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0:00 obrigado pelo convite deixe-me começar minha apresentação 0:11 usando a tecnologia crisper cast 9 0:17 a apresentação de hoje será dividida em parte primeiro apresentarei o uso do 0:22 tecnologia crispr cas9 para tratar a doença diária da íris e minha pós-graduação 0:27 o aluno gabriel de mart apresentará todos os derivados do crispr cas9 0:32 tecnologia pode ser usada para detectar infecção viral 0:39 a palavra crispr significa repetições de penetração curta no interespaço regulatório agrupado 0:48 A tecnologia crispr cas9 é derivada de pesquisas sobre bactérias, foi descoberta inicialmente em 2005 0:56 que a sequência mais nítida continha sequência viral e sim, havia uma 1:02 hipótese de que crispr cas9 é o sistema imunológico bacteriano 1:07 foi só em 2013 que se descobriu que o crispr cas9 1:13 pode ser usado para induzir modificação específica do genoma humano e isso começou 1:20 uma grande explosão de artificial, de fato, o sistema de fundição crispr é usado 1:28 por bactérias para matar bacteriófagos os bacteriófagos são extremamente abundantes, são 10 vezes mais 1:34 abundante do que as bactérias e há uma guerra que está em curso 1:39 entre bactérias e bacteriófagos desde milhões de anos 1:46 foi inicialmente descoberto que eles estão no genoma uma sequência repetida constante 1:55 pesquisadores estavam se perguntando para que serviam essas sequências repetidas e então descobriram que o 2:01 sequência entre a repetição constante ou sequência que surgiram do genoma de vários 2:08 bacteriófago na verdade o que normalmente acontece é quando um 2:14 Bactérias infectadas por bacteriófagos normalmente as bactérias do vento bacteriófago estão mortas 2:20 mas às vezes você tem um vírus defeituoso que infecta sem matar a bactéria, mas eles então 2:26 ser capaz de adquirir alguma parte da sequência do vírus e armazenará isso em seu genoma 2:34 e estará pronto quando precisar desse bacteriófago novamente no futuro 2:41 do dna na área crispr as bactérias irão primeiro expressar a alergia pré-cr e então haverá 2:48 ser um complexo que será feito entre tracker ou cr rna 2:53 e a proteína de ferro fundido esta proteína striker rna crna cas9 3:00 complexo irá então se ligar com as bactérias de hdna e induzir um corte do bacteriófago 3:08 DNA para essencialmente matar o vírus 3:14 para se ligar ao dna a proteína cas9 requer a presença do espaçador total 3:20 motivo adjacente que é simplesmente njj para este streptococcus pyrogene 3:29 então existe um crrna que contém uma sequência variável de 20 3:35 nucleotídeos que serão complementares à sequência do bacteriófago e depois há também o rastreador rna 3:42 que é uma sequência de rna constante que forma um complexo com o crm 3:48 quando as três partes estão juntas cr rna tracker rna na proteína cas9 3:54 o corte será induzido em exatamente três nucleotídeos 4:02 é claro que uma vez que esta é uma guerra há uma contra-medida que são tomadas pelo fago que eles vão 4:07 mutam seu genoma para que se tornem resistentes e não sejam reconhecidos pelo cr 4:13 rna e sobreviverá à defesa bacteriana 4:20 o big bang do crispr cas9 começou em 2012, quando a geração x e seus colegas perceberam que 4:27 a tecnologia de roque crispr pode permitir cortar o genoma de planetas e animais que eles também 4:35 fundir seu cr rna e o rastreador rna juntos para formar um único guia rna isso foi feito 4:44 essencialmente porque o guia único rna é algo que pode ser patenteado 4:49 Considerando que o crrna e o rastreador são naturais, não podem ser patenteados 4:58 durante o ano seguinte houve uma explosão de artigos confirmando que a tecnologia crispr 5:04 pode ser usado para cortar o genoma de bactérias células humanas carboidratos animais ratos sapos peixes-zebra plantas vôos 5:12 limitou esses macacos 5:17 muitos desses artigos foram publicados em revistas de prestígio como a Nature 5:23 ciência natureza biotecnologia célula molecular célula molecular 5:30 houve uma rápida explosão de artigo e, como você pode ver, em 26 de novembro de 2020 5:38 21 420 artigos foram publicados onde a palavra crispr é mencionada 5:47 a principal razão desta rápida explosão de artigos é que custa muito menos derivar 5:54 uma sequência que será capaz de cortar uma sequência específica do genoma em comparação com outras 6:01 tecnologia pré-existente, como proteína de dedo de zinco e alfaiates 6:07 como mencionado antes da ligação da proteína cas9 ao dna 6:13 exigia a presença de um espaçador de garrafa adjacente ao conceito pam que é njj para o cas9 6:20 derivado do g cético há então a ligação também do 6:26 rna guia único que reconhecerá a sequência de 20 nucleotídeos 6:31 e quando o complexo é feito entre a proteína cas9 o único guia rna o dna lá 6:38 é um corte que será feito a exatamente três nucleotídeos da panela 6:46 uma vez dentro do núcleo, o complexo resultante travará em uma sequência curta conhecida como pan 6:54 o cas9 irá descompactar o dna e combiná-lo com o rna alvo 7:01 se a partida estiver completa, o elenco 9 usará duas minúsculas tesouras moleculares para cortar o 7:06 dna quando isso acontece a célula tenta 7:12 reparar o corte, mas o processo de reparo é propenso a erros, levando a mutações que podem desabilitar 7:18 o gene que permite aos pesquisadores entender sua função [Música] 7:23 essas mutações são aleatórias, mas às vezes os pesquisadores precisam ser mais precisos, por exemplo, substituindo um gene mutante 7:30 com uma cópia saudável isso pode ser feito adicionando outro pedaço de dna que carrega a sequência desejada 7:38 uma vez que o sistema crispr tenha feito um corte, este modelo de DNA pode emparelhar com as extremidades cortadas 7:43 recombinando e substituindo a sequência original pela nova versão [Music] 7:53 uma das razões da rápida explosão é que o aumento da tecnologia de bypass também usou tudo o que foi desenvolvido pelo gene 8:01 terapia nos 30 anos que a precederam temos melhor para entregar o dna 8:07 usando lipossomas de polímeros catiônicos de vírus associados a aav 8:12 operação eletro de microinjeção todas essas técnicas são usadas no contexto de crispr 8:20 quando uma quebra de fita dupla é produzida no dna, a maioria das quebras será reparada por 8:26 adjacentes não homólogos que levarão a micro deleção ou micro 8:32 inserção isso é freqüentemente usado para eliminar a expressão de um gene por 8:37 alterando o quadro de leitura e também pode ser reparado por reparo dirigido por homologia 8:43 que requerem a presença de um DNA doador que contém sequência de homologia com o que 8:49 está recuando o que está seguindo o corte e entre as duas sequências de homologia 8:55 há uma sequência em azul que pode ser um único nucleotídeo ou um gene inteiro que será 9:00 inserido no lado da quebra de fio duplo 9:06 quando utilizamos a tecnologia crispr cas9 pretendemos produzir uma quebra de fio duplo 9:12 em um local preciso no genoma humano, no entanto, o cas9 às vezes pode induzir corte em 9:18 outros locais no genoma que são chamados de software de computador de mutação fora do alvo podem prever esses 9:25 mutação fora do alvo usando toda a sequência do genoma humano, no entanto 9:30 esses softwares não são perfeitos e às vezes imprimem fora do alvo 9:36 mutação no local onde não há corte e às vezes haverá um corte no lado que não é previsto 9:42 pelo computador existem ou no entanto alguns experimentos 9:50 técnicas como um método guia sec que permite identificar experimentalmente os locais 9:57 de mutação alvo esta técnica guidesec usou a introdução de um curto 34 base 10:05 par de oligonucleotídeos no local dos cortes e posteriormente por pcr 10:10 o local de inserção pode ser identificado por sequenciamento 10:16 a presença dessas mutações fora do alvo é o principal problema que atrasa o uso 10:23 da tecnologia crispr cat9 para correções diretas do veículo 10:31 um dos métodos para reduzir a mutação alvo é simplesmente reduzir em dois ou três o 10:37 número de nucleotídeos do rna guia único que está se ligando ao dna alvo 10:46 outro método é usar uma nuclease cas9 mutada que corta apenas uma fita de dna. 10:53 então chamada de rótula existe variação de cas9 onde o nikkei corta apenas a parte de baixo 11:01 fita de dna e outra mutação de cas9 que permite cortar apenas a fita superior 11:08 de dna só é possível induzir 11:14 quebra de fita dupla no dna usando o cas9 nikkei 11:19 e dois rna guia único, cada um detectando uma sequência de 20 nucleotídeos perto de 11:25 entre si, também é possível usar um 11:30 elenco não funcional 9 que, em seguida, elenco 9 fusível de nuclease 11:36 com um nucleado, em seguida, duas áreas de ferro guia necessárias para detectar 11:42 sequência que estão próximas uma da outra e as nucleas da frente precisam formar um dímero 11:48 para poder cortar o dna 11:53 finalmente alguns pesquisadores mutaram o gene que codifica de cas9 eles têm 12:00 modificou alguma sequência codificadora de aminoácidos para reduzir a 12:07 ligação entre o cas9 e o dna 12:14 o gene sp cas9 é muito grande para ser inserido com um único rna guia dentro de um adeno 12:20 vírus associado e, portanto, os pesquisadores identificaram cas9 de outras bactérias 12:27 que são menores, por exemplo, este estafilococo provavelmente é fundido 9 é menor que 12:33 o sp 9 mas tem um caminho diferente que é mais restritivo 12:41 outro tipo de enzima crispr cas9 foi identificado, chama-se cpf1, produz pegajoso 12:48 câncer é outro corte do dna 12:54 há apenas toda uma série de vários fundidos obtidos de várias bactérias 13:00 que requerem diferentes tipos de 13:06 A tecnologia crisprcas9 pode ser usada não apenas para reduzir cortes no DNA, mas 13:11 também pode ser usado para induzir a expressão de um gene fundindo cast 9 com bp 13:16 64 por exemplo ou ferro com caranguejo para reprimir a expressão de um gene 13:26 no meu grupo de pesquisa estamos usando a tecnologia crispr cas9 para desenvolver terapias para várias doenças 13:33 muita ataxia design distrofia muscular e doença de alzheimer vou apresentar isso agora 13:41 inicialmente usamos a tecnologia crispr cas9 para desenvolver um tratamento para água doce 13:47 táxi é uma doença adidas devido à presença de um longo 13:53 tri-nucleotídeo com bgaa no íntron um dos genes fertilizantes deste 14:00 repetição longa reduzem a expressão do gene da fataxina levando a 14:07 problemas neurológicos e cardíacos acabamos de usar o crispr cas9 14:13 tecnologia e gerado guia único rna capaz de cortar no intron 1 antes 14:21 e após a repetição do trinucleotídeo levando à sua remoção e aumentando a expressão da ataxia 14:31 de fato, a remoção da repetição de trinucleotídeos nas células do yg8 14:38 modelo de camundongo sr de ataxia fredérica dobrou a expressão de fataxina 14:44 em comparação com as células não tratadas e elevar a expressão de proteção para 14:50 quase o nível normal o gene sp cas9 é muito grande para ser 14:56 entregue com dois rna de tripa única por um único aav 15:01 estamos apenas usando o gene cgcas9 menor para remover o trinucleotídeo no íntron 15:09 um dos genes da fataxina usando esta nuclease cg cas9 menor 15:18 também somos capazes de remover a repetição de trinucleotídeos no íntron 1 do gene da fratexina 15:27 também estamos usando a tecnologia crispr cas9 para desenvolver um tratamento para duchenne 15:33 distrofia muscular a distrofia muscular de duchenne é devido a 15:38 mutação em um gene que codifica para a proteína distrofina é um gene grande contendo 79 éxons 15:47 alguns desses éxons não contêm um múltiplo de três nucleotídeos e, portanto, setenta 15:53 por cento dos casos de distrofia muçulmana de duchenne são devidos à deleção de um ou vários exões e o total 16:00 número de nucleotídeos de codificação que são deletados não é um múltiplo 16:05 de três por exemplo nesta apresentação temos 16:12 uma deleção do exon 50 que não contém um múltiplo de três nucleotídeos 16:18 isso leva a uma mudança de quadro e haverá um códon de parada no exon 51. 16:24 assim, no início disso, a proteína distrofina é expressa, mas não no final da distrofina 16:30 proteína esta situação pode ser corrigida induzindo o salto que é o 16:36 remoção do exon 51 no rna mensageiro 16:41 isso é feito usando oligonucleotídeo antisense este exon 51 também pode ser deletado 16:50 induzindo cortes no intron 50 e na frente 51 para remover completamente 16:56 que exon isso resulta na expressão do início de 17:02 a proteína distrofina e do fim da proteína distrofina, mas há, no entanto, 17:08 uma pequena parte da proteína que está faltando no centro da proteína a remoção 17:15 de um ou vários exames completos pode assim restaurar o quadro de leitura e 17:21 converter um paciente de duchene em um paciente de Becker, no entanto, alguns pacientes de apoio têm graves 17:29 sintomas e são obrigados a uma cadeira de rodas aos 11 anos. 17:34 portanto, a melhora de algumas distrofias musculares de duchenne pode não ser significativa 17:42 isso ocorre porque a proteína distrofina tem uma estrutura complexa de fato em sua parte central 17:49 a proteína distrofina contém 24 repetições semelhantes a espectro 17:56 cada ligadura de espectro é feita de três hélices alfa hélice a linux b 18:03 e exc note que nx a está começando no lado esquerdo e elix c 18:09 está terminando no lado direito e normalmente há uma sucessão de abc abc abc 18:19 o principal problema de deletar o exame completo para restaurar a expressão da proteína distrofina é 18:26 que o início e o fim da repetição do tipo espectro indicado neste esquema pelo preto 18:33 seta não correspondem com o início e o fim dos exílios e, portanto, ao remover absorção completa 18:41 o resultado da estrutura de repetição do tipo espectro pode não ser normal 18:49 computação do vetor muscular tem uma deleção de um ou vários éxons, mas o total 18:55 número de nucleotídeos de codificação que são deletados é um múltiplo de três nucleotídeos e, portanto, há 19:02 sem mudança de quadro, este é o caso, por exemplo, do paciente Becker com uma exclusão do exemplo 45 19:09 para 47 ou com uma exclusão de 45 a 49 em ambos os casos, não há deslocamento de quadro 19:16 O início e o fim da proteína distrofina são expressos no local de junção entre o 19:24 códons restantes há uma estrutura anormal da proteína distrofina e 19:31 devido a essa estrutura anormal da proteína distrofina, esses pacientes vetores estão ligados a um 19:36 cadeira de rodas em tenra idade 19:43 assim no meu grupo de pesquisa em vez de tentar restaurar o quadro de leitura normal 19:48 excluindo exons completos, visamos produzir um exame evaline 5054 19:56 que não apenas restaura o quadro de leitura normal, mas exige uma proteína distópica com um 20:03 estrutura normal, fizemos nossos experimentos iniciais usando o mioblasto de um 20:08 paciente duchenne com deleção do exame 51 52 e 53. 20:14 assim, porque o número de nucleotídeos de codificação não era um múltiplo de três, havia um códon de parada 20:22 no exame 54 devido ao deslocamento do quadro, acabamos de usar um cas9 mais nítido 20:28 tecnologia para induzir um corte no exon 50 e um corte no exon 54 para criar o exame e-braid 50-54 20:39 para produzir este exame de imigração identificamos inicialmente quais são os possíveis sp cas9 20:46 pam ou qual outro local onde podemos cortar no exon 50 e no exon 54 identificamos 20:54 10 locais de tempo no exame 50 e 14 tamanhos de bandeja diferentes no exon 53. 21:02 esta tabela prevê quais são os resultados da indução de cortes no exame 50 21:08 e no exame 54. quando temos um quadrado azul significa que o 21:16 cut foi produzido no exon 50 logo após os três nucleotídeos e 21:22 pede um aminoácido e o corte foi produzido no exon 54 21:29 logo antes dos três nucleotídeos que codificam um aminoácido, portanto, no ponto de junção, temos o amino 21:37 ácidos que são um escoltado pelo exemplo 54 seguido imediatamente por um aminoácido 21:44 codificado pelo exemplo, não há amizade e não há produção de novo aminoácido 21:51 porém quando a praça está limpa isso significa que temos no entroncamento 21:58 local um novo aminoácido que é produzido porque somos cortados no exon 50 22:04 logo após um dos nucleotídeos do códon e os dois nucleotídeos que irão 22:09 completar esses códons são exóticos antes de cortarmos 22:14 logo após um nucleotídeo do códon no exame 54 e, portanto, primeiros dois nucleotídeos à esquerda 22:22 para criar um novo códon no local de junção, há apenas um novo aminoácido no 22:28 local de junção, mas não há mudança de quadro e todos os outros aminoácidos 22:33 são os corretos também é possível com este quadrado em vermelho ter um novo 22:40 códon produzido no lado da junção, mas esse novo códon é um códon de parada 22:46 não é real, queremos fazer todos os quadrados de largura porque 22:52 há uma mudança de quadro que estamos cortando após um nucleotídeo do códon no exon 15 22:57 e estamos cortando antes do último nucleotídeo do cooldown no exame 54 e, assim, adicionamos a junção 23:06 lado há um novo códon que é feito porque há uma mudança de quadro 23:11 e todos os aminoácidos a seguir não são os corretos 23:18 temos testadores de poeira lá sua esfera de guia ironia um guia ironia cortando na zona 50 e 23:25 o outro corte de engomar guia no exon 54 isso produziu um exame ibrit 1554 23:32 que tinha o tamanho previsto para este exame híbrido, observe que quando 23:39 estão fazendo cortes no exame 50 e no exon 54 em uma distrofina normal 23:45 estamos excluindo 160.000 pares de bases e apesar disso a junção entre 23:52 exon 50 e 54 é do tamanho previsto temos sequência 24:01 este exame de elite que foi produzido por corte no exon 50 e no exon 54. não só 24:08 o exame eblid era exatamente do tamanho previsto 24:14 mas a sequência também foi exatamente como previsto, por exemplo, tivemos um local de junção o 24:21 fusões do exon 50 e do exemplo 54 produzindo exatamente o amino previsto 24:29 ácido também obtivemos no sítio de junção um novo códon codificando para o predito 24:36 aminoácido ou codificação para um códon de parada e às vezes como previsto pelo branco 24:43 quadrado, tivemos uma mudança de quadro e quando houve uma mudança de quadro, houve cooldowns de stubs que foram atendidos 24:51 nos exames resultantes 24:58 como mencionado anteriormente a proteína distrofina contida em sua parte central 24 do espectro como 25:05 repita cada um sendo feito de três hélices alfa a b e c acabamos de usar um guia rna para 25:13 induzir um corte no exon 50 em uma sequência que codifica para lxc 25:19 e outro rna guia induzindo um corte no exon 54 também em uma sequência que codifica a hélice c 25:26 a evidência resultante exon 5054 pede um ibrahim 25:33 alex c onde o início de nxt é codificado pelo exon 50 e o final 25:40 de lxc é codificado pelo exon 54. esta é uma estrutura que foi 25:45 computador previsto usando a sequência da proteína resultante 25:54 quando o biovidro dessa paciente de duchenne teve uma deleção do exame 51 a 53 26:00 são fundidos para formar algumas pequenas fibras musculares e cultura chamada miotubos, na verdade, esses músculos 26:07 fibras não expressam distrofina porque este é um paciente de vergonha, porém o mioblasto de um 26:13 humano saudável, quando se fundem, formam um pequeno biotubo e expressam isso 26:19 tópico como pode ser visto aqui neste sangue ocidental quando usamos o bioblasto da duchenne 26:25 paciente e induzimos a formação do exame de ignição 50-54 temos expressão 26:32 da proteína distrofina em cultura e como você pode ver esta proteína distrofina 26:38 tem um peso molecular menor do que a distrofina normal porque há deleção do exon 51 a 53 26:46 e uma exclusão adicional de parte do exon 50 parte do exame 54, portanto, há uma parte 26:53 da proteína distrofina que está ausente e é por isso que a proteína é menor 26:59 mas, no entanto, é expresso para nossos experimentos iniciais in vivo 27:06 usamos o modelo de camundongo hdmd este é um camundongo transgênico que 27:12 expressou o gene da distrofina humana todos os íntrons em todos os éxons 27:18 nós eletroporamos no músculo deste revestimento de plasmídeo de camundongo para o sp cas9 27:26 combustíveis com a proteína verde fluorescente e dois rnas únicos guia este 27:33 um mês depois quando tiramos o músculo havia expressão do verde 27:38 proteína fluorescente confirmando que o plasmídeo 27:43 foram eletroporados corretamente nas fibras musculares levando à expressão do 27:49 proteína verde fluorescente e provavelmente também levando à expressão do sp ferro fundido 27:55 e depois de dois deslizes, extraímos o dna desses 28:02 músculo e primeiro confirmamos usando um teste chamado de enzima 28:08 que, de fato, eles estavam sendo constantemente produzidos nos exames 50 e 54. 28:15 use pcr para amplificar o ebrade exon 5054 28:21 observe que nos músculos que não são tratados com a tecnologia crispr cas9 28:26 não há amplificação do exemplo 5054 porque há 160.000 pares de bases 28:33 entre esses dois exons e, portanto, os dois primers para o pcr são muito 28:40 separados um do outro 28:50 nós então sequenciamos este exon 5054 que foi produzido in vivo 28:58 no músculo do camundongo expressando o gene da distrofina humana e como previsto tivemos a sequência de 29:05 exon 50 e um novo códon no sítio de junção 29:10 seguido por todos os códons corretos que codificam para o aminoácido normal 29:16 no exon 54. isso é exatamente como previsto in vivo 29:24 no entanto, para uma entrega do gene cas9 in vivo para vários músculos 29:32 precisamos usar um vírus adeno associado como mencionado antes do sp cas9 29:38 g é muito grande para ser entregue com ironia de dois guias por um único aav e, portanto, usamos para 29:46 nossos próximos experimentos o elenco 9 do staphylococcus moleus 29:51 que é um cas9 menor que permite a entrega com dois rna guia por um único avp 29:58 neste caso utilizamos uma guia rna que realiza cortes 30:05 no exon 47 em uma sequência que codifica para elix b e no exon 58 30:12 em uma sequência que codifica novamente para elix b isso resultou na formação de um 30:18 ebola exoma 4758 codificação para um ibrigid 30:24 hxb que tem uma estrutura normal o início do lxb sendo codificado 30:30 pelo exon 47 e o fim desse mal 30:36 ser codificado pelo exon 58 30:42 então usamos para nosso experimento indiv um novo modelo de mouse chamado hdmp delta 30:50 ii é o mesmo modelo de mouse que anteriormente que contém 30:55 o gene da distrofina com todos os éxons e todos os íntrons, exceto aquele 31:01 este camundongo tem uma deleção do exame 52 e, portanto, não há expressão do gene distrofia humano 31:09 usamos assim a tecnologia crispr cas9 para induzir um corte no exon 47 31:15 e um corte no exame 58 produzindo o exame eberlini 4758 31:21 resultando na produção de uma proteína distópica contendo um exemplo de ibrite 31:28 em lxp injetamos nesses hdmd delta 52 31:38 codificação do mouse aev para sc cast 9 e 2 single guide rna 31:43 um mês depois observamos no músculo a expressão do gene da distrofina humana incluindo 31:51 no coração estamos apenas propondo um tratamento de 31:56 distrofia muscular de duchenne que seria a entrega sistêmica por um vírus adeno associado 32:03 da classe 9g e de dois guia rna para formar qualquer exame de pão em contraste 32:10 com salto de exame que é um tratamento feito no nível da mensagem rna o tratamento que nós 32:16 propor ao nível do dna seria permanente 32:22 a tecnologia crispr cas9 está evoluindo rapidamente e novas tecnologias derivadas do 32:28 crispr cas9 permite agora a modificação de um único nucleotídeo 32:36 mais de 32.000 modificações de um único nucleotídeo são responsáveis ​​por 32:43 ouvindo doença constante e, portanto, a capacidade de corrigir um único nucleotídeo 32:49 forneceria tratamento para a maioria dessas doenças estáveis ​​em cura 32:55 o primeiro tratamento que permite a modificação de um único nucleotídeo foi desenvolvido por comando em 2017 33:04 que usou uma capa de joelho cas9 que é a classe modificada cas9 que é capaz de cortar 33:11 apenas um fio de dna e este estojo fundido 90 é fundido 33:16 com acetidina desaminase esta tecnologia de forma impermanente clinicamente 33:23 modificar o city bean em um uvd que é substituído 33:28 por um tempo de reparo do DNA 33:34 a principal limitação dessa técnica é a modificação química da vontade ctd 33:40 ocorrem em uma janela estreita localizada em 12 a 16 pares de bases do 33:47 ngg pan usamos inicialmente a edição base 33:55 tecnologia para desenvolver um tratamento para a doença de Alzheimer 34:04 a doença de Alzheimer é produzida por um metabolismo anormal da munição 34:12 proteína normalmente esta proteína é cortada pelos secretários alfa 34:18 seguido por um corte pelas simetrias gama que produzem peptídeos e proteínas 34:24 fragmentos que são degradados sem causar nenhum problema, porém esta proteína também pode ser cortada por 34:31 a sequência beta seguida por um corte pelos secretários gama e isso produziu 34:37 peptídeos medianos beta longos de 40 42 aminoácidos que 34:44 agregam-se uns aos outros formando aminoácidos que interferem nas 34:50 transmissão levando à morte do neurônio e os problemas de memória 34:58 este esquema ilustra a sequência de aminoácidos da parte transmembrana do 35:04 proteína de repressão anaeróbica podemos ver a posição do beta alfa 35:09 e gama separa fora de todos os aminoácidos a estrela acima de sua 35:15 nome são aminoácidos que são quantificados levando à família da versão da doença por favor 35:24 observe a posição com a seta vermelha esta é a alanina na versão 673 35:30 quando esta adenina é alterada por vale, isso leva a doença de Alzheimer de início precoce grave e você 35:38 são azamara aos 40 anos. porém quando esta adenina é 35:47 105 anos como mostrado por johnson nepal na natureza 2012. 35:57 a presença da mutação a673t também conhecida como a mutação islandesa 36:03 mutação reduzem a secreção de um beta 40 em nosso peptídeo beta 42 36:10 para o tipo selvagem eppg e para appg contendo a mutação london 36:20 nossos experimentos mostraram que a presença da mutação a673t 36:27 reduzir a secreção de um peptídeo beta 40 e beta 42 pelo epp 36:35 genes não apenas para o gene do tipo selvagem, mas também para genes app contendo vários genes familiares. 36:42 Mutações da doença de Alzheimer 36:49 como mencionado antes da tecnologia de edição base crispr cas9 36:54 permitir modificar a cidade em um tempo 37:02 acabamos de usar a tecnologia de edição básica para atingir o citoplano 37:10 na fita antecedente do códon alanina transformando essa citodina em um 37:16 e apenas mudando o códon de alanina em um triângulo 37:25 o principal problema com esta abordagem é que, embora queiramos modificar a citodina 37:32 na fita descendente final do códon de adenina existem outros nucleotídeos de acidez 37:40 próximos que também são afetados pela abordagem de edição básica 37:48 construímos 14 enzimas de edição de base diferentes para poder modificar 37:55 mais especificamente no cooldown anti-sentido da anatomia 38:04 modificando a cidade e o códon antisense do led, conseguimos introduzir o h673t 38:12 mutação em até 17 do avpg no entanto 38:19 outras cidades também localizadas no estrato antecedente também foram modificadas por essa abordagem 38:29 uma nova tecnologia fantástica chamada privada foi recentemente desenvolvida pela enceladus 38:36 com licenças em princípio para substituir qualquer nucleotídeo por qualquer 38:45 a outra tecnologia de edição usa um decaimento cas9 fundido com um reverso 38:52 transcriptase também requer um guia de edição principal rna conhecido como remédio para porco 39:05 o peg rna é essencialmente um único guia rna prolongado porque como um único 39:11 guia rna contém uma sequência espaçadora que reage com 20 nucleotídeos 39:18 no dna de destino, ele também contém o andaime constante do único 39:24 guia rna que está em vermelho e, em seguida, em sua extremidade uh cinco primo há um 39:31 prolongamento com o lado de flexão do primer que é uma sequência de 10 a 39:37 17 nucleotídeos reagindo com a fita superior do dna 39:42 isso é seguido pelo modelo de transcriptase reversa novamente, que é de 10 a 17 nucleotídeos em 39:50 comprimento e que conterá algum nucleotídeo modificado em vermelho neste caso 39:57 indicando qual nucleotídeo deve ser modificado pela transcriptase reversa 40:06 um plasmídeo projetado por anzalone em tudo 40:12 está disponível no edgy para construir um novo peg rna 40:22 este colega de classe contém um gene de proteína fluorescente vermelho que pode ser removido por cortes bsa1 que 40:28 produzir uma espinha dorsal da proteína e, em seguida, os outros componentes são o primer espaçador que liga o lado inverso 40:35 modelo de transcriptase e o bisturi de RNA de porco, todas essas sequências são únicas 40:40 oligonucleotídeo de fita que pode ser adquirido da idt essas quatro partes são então montadas 40:47 juntos para produzir um novo pegaron 40:53 para usar a tecnologia de edição principal, primeiro temos que identificar a guia adjacente do espaçador de fotos 41:01 que é njj para o elenco nove de streptococcus pyrogene 41:08 isso permitirá que o cas9 se ligue ao dna, então a sequência espaçadora do peg rna 41:15 se ligará a uma sequência de 20 nucleotídeos de dna, neste caso a fita inferior 41:20 e a formação do complexo entre os decaimentos do peg rna classe 9 e o dna 41:28 induzirá o corte a exatamente 3 nucleotídeos da panela e a fita superior do dna isso 41:36 liberar a fita superior de dna para poder interagir com o lado de ligação do primer de 41:43 o peg rna e, em seguida, o modelo de transcriptase reversa 41:49 que continham poucos nucleotídeos a serem relacionados estarão disponíveis para o 41:55 transcriptase reversa para sintetizar uma nova fita superior de DNA 42:04 muitos pacientes com distrofia muscular de duchenne têm um dmdg de códon de parada, pois não tivemos acesso 42:13 às células do paciente contendo tal apontamento decidimos introduzir estas paradas 42:20 códons usando a principal tecnologia de edição, então em cada caso tínhamos que identificar um ngg 42:29 identificar a sequência do protoespaçador peg rna e, em seguida, modificar a sequência inversa 42:36 modelo de transcriptase para entrar para modificar um 42:41 códon para um aminoácido em um acionista, neste caso, mudamos 42:51 para apresentar o material tga 42:57 usamos com sucesso essa abordagem para introduzir o exame de códon de atordoamento 9 43:03 20 35 42 55 e 61. 43:12 acabamos de projetar vários rna de porco direcionados ao dmd exon 35, como você pode ver 43:19 variamos o modelo de transcriptase reversa em azul de 10 a 16 nucleotídeos 43:27 e também variamos o sítio de ligação primária em verde de 10 a 15 nucleotídeos 43:35 e no local de mutação desejado que introduzimos em 43:42 introduzir essa mutação 43:48 nossos experimentos iniciais foram feitos em células hgk 293 43:55 tentamos reproduzir a mutação de mx1g e direcionar 44:03 dmd exon 35. então, essencialmente, essas células foram transfectadas 44:08 com codificação de plasmídeo para o cas9 djs se funde com os dias de transmissão reversa 44:14 e um rna pago visando o exon 35 do gene dmd 44:20 ou o gene emh one o dna foi extraído três dias depois 44:27 e a sequência alvo foi amplificada por pcr e sequenciada usando o método central 44:34 a sequência foi analisada usando o programa online edit r essencialmente observamos 44:41 uma mutação de correção 32 do gene air x1 como 44:48 feito apenas por cabeças, no entanto, para a mutação do exon 35 44:55 tivemos um fundo 2 na sequência do controle negativo 45:02 controle e com os diferentes peg rna temos mutação variando de quatro a oito 45:10 por cento, então isso não foi tão bom quanto para o e mx one g 45:20 acabamos de tentar métodos diferentes para tentar aumentar a porcentagem de edição do genoma 45:26 do exon 35. o primeiro método que tentamos é repetir o tratamento três vezes 45:33 essencialmente as células foram transfectadas com plasmídeo no dia 0 6 12. 45:40 e o DNA foi extraído três dias e seis dias após cada tratamento 45:48 amplificamos o exon 35 pcr em cada uma das datas de extração 45:55 e sequencie-o por sequência do remetente e do analisador, pois você pode ver a porcentagem do genoma 46:02 edição aumentou do dia 3 para o dia 18 com o tratamento repetido 46:08 e este foi o caso de todos os três peg rna que visavam 46:18 testamos então um segundo método para tentar aumentar a porcentagem de mutação no exon 35. 46:26 é para induzir uma segunda escavação no gene alvo este é o método pe3 46:33 essencialmente, identificamos duas sequências pam que permitiram ao kite rna induzir 46:40 um segundo corte e 57 nucleotídeos do original 46:47 grande nome celestial ou em 24 cleotide do rebanho pagão 46:57 quando induzimos uma segunda etapa às 24 horas nucleares ou 47:04 em 57 nucleotídeos induzidos pela alergia ao peg houve um 47:10 aumento significativo na adição do gene alvo para ferro-gusa nos 35 47:16 4 e pig rna 256 mas não para maior e e35 você ainda tem que 47:23 entenda porque 47:30 um terceiro método para melhorar a porcentagem de mutação no gene alvo é mutar 47:37 a panela usada pela harmonia de peg 47:44 acabamos de projetar rna de porco que não só foi capaz de introduzir um códon de parada 47:50 mutação, mas também somos capazes de mutar simultaneamente 47:56 a panela e o uso 48:02 mutação do pan usado pelo peg rna melhora a porcentagem de mutação em 48:08 o códon de parada para dois dos três peg rna que nós 48:14 testei 48:20 combinando os dois métodos que estão induzindo um segundo corte no alvo g 48:26 e a mutação do pan usado pelo peg rna aumenta ainda mais a mutação do dmd 48:34 exon 35 a 39 com todos os três pinos que temos 48:46 testado, estamos iniciando um novo projeto para corrigir a mutação 48:53 responsável por outra doença estável, estamos trabalhando na fibrose cística devido a 48:59 mutação no canal de cloreto cftr em músculo congênito 49:04 distrofia por mutação no receptor de reanodina e em 49:10 ataxia 8 devido a mutação no gene nkx6 tipo 2 49:20 para cada período doença constante devido a uma mutação pontual, por exemplo, aqui com ataques em 49:27 tipo 8 é possível corrigir em princípio o gene mutado usando a edição prime 49:33 tecnologia neste caso aqui podemos identificar que a mutação é uma mudança de adenosina para o tempo 49:41 e assim podemos identificar um pam njg para o ferro fundido sp que está próximo ao nucleotídeo mutado 49:49 podemos então projetar um plano rna que irá introduzir a mutação desejada neste 49:55 caso estamos introduzindo duas mutações uma para corrigir a mutação para reverter a timodina 50:02 em uma adenosina e a segunda mutação do ponto médio 50:07 é modificar o caminho para que, após a correção, a enzima cad9 não possa mais se ligar a 50:15 as tecnologias derivadas do dna crispr cas9 podem não 50:24 ser usado para tratar muitas doenças individuais, o principal problema continua sendo o inibidor 50:29 entrega dos agentes de edição 50:35 Obrigado pela sua atenção 50:43 ok obrigado professor jax uh vou aproveitar a vez para fazer um comentário geral para quem 50:52 quem não fala uh quem não fala inglês ok obrigado pela sua apresentação 50:58 obrigado, claro

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0:00 Oi boa noite a todos 0:03 e eu vou me apresentar vocês 0:06 Olá meu nome é Luís Berger Fronteira 0:09 outro médico eu sou pega de pela 0:13 Universidade Federal de Medicina em 0:17 medicina e só tem um pós-doutorado Em 0:21 genética pela pela Fiocruz Rio de 0:25 Janeiro eu tinha um serviço de 0:28 imunologia e alergia 30 spray Natal da 0:31 Santa Casa do Rio de Janeiro e 0:34 provavelmente esse serviço o serviço 0:36 mais antigo do Brasil foi criado pelo 0:41 que eu sou Clementino Fraga filho e seu 0:43 primeiro chefe tem eu fui Assistente por 0:47 isso eu sou Antonio de Oliveira Lima em 0:50 o nosso nosso 0:54 e a nossa palestra eu resolvi fazê-la em 0:59 português e vai ser tem o objetivo de 1:03 transmitir para vocês os conceitos 1:06 básicos de e mundial do Cristo permanece 1:10 Norte eu vou falando em português mas eu 1:14 vou fazer uma saudação ao produtor 1:16 Jackson Black é em inglês e o Gabriel 1:19 depois eu volto para o português eu 1:23 quero agradecer muito a organização você 1:28 inventa protagonista na Carvalho e o 1:31 Doutor Marcelo popular 1:34 é o dia do impressor Jackson André isso 1:38 aproveite o Norte do Rio Words about 1:41 Christmas on 1:43 Oi Espera ai ai cursei Christian and 1:47 triggering Factor of motion 1:51 e está a Nice place in the chapter of 1:54 life 1:55 a entrar ai ajuda de admitir e ouvir sua 2:00 opção 2:01 A Lenda de líquidos thank you and Doctor 2:06 good download for Action and citation 2:11 eu não aguento tu ser mais fim eu peguei 2:16 a amar mais pó 2:19 a montando o inglês mas temos hoje a 2:22 rede honra modera um seminário 2:24 internacional de ciências farmacêutica a 2:27 perspectiva diagnóstica e terapêutica 2:30 utilizando a tecnologia Christopher a 2:34 os jogadores desse evento é a faculdade 2:43 de Filosofia Ciências e Letras do Alto 2:45 São Francisco o professor Thales Renato 2:48 Ferreira Carvalho e Canadá Gene therapy 2:52 on 2:54 nós não temos os palestrantes professor 2:56 Jackson indo é porque eu sou do 2:58 departamento de medicina molecular Vila 3:00 Walter Becker Canadá ele para falar 3:04 sobre o uso do cristo para tratar 3:06 doenças hereditárias no segundo o 3:09 palestrante será o Doutor Gabriel o amor 3:11 EA do trabalho do laboratório de 3:13 medicina molecular da Universidade laval 3:16 Quebec Canadá ar e falará sobre o uso 3:24 e a uso da tecnologia derivada do cristo 3:27 para detectar infecções virais e eu como 3:32 moderador 3:33 e o apoio departamento de medicina 3:36 molecular da Universidade laval laval 3:39 Quebec Canadá 3:41 E a faculdade pelos dias sem acento em 3:43 letras do Alto São Francisco Associação 3:47 Brasileira beneficente de apoio Alerta e 3:50 pernas grades e no teto e Associação de 3:53 saúde sustentabilidade a Deus que é uma 3:55 associação Nossa com objetivos sociais 3:59 na medicina no serviço de imunologia 4:02 Clínica e alergia da Santa Casa do Rio 4:05 de Janeiro e a clínica imunoderm ó eu 4:09 vou começar a falar com vocês são 4:13 assuntos tentando explicar de maneira 4:17 bem pragmática e os conceitos 4:21 fundamental do Cristo atrás 9 4:24 bom então o sistema aquífero slide 4:27 inglês Sweet Life Into Space on with it 4:32 e é são repetições pane Drone eu vou 4:36 falar para vocês também que que 4:38 significa essa palavra pamidronico ou 4:40 seja repetições põe crônicas curtas 4:43 agrupadas e regularmente interespaçadas 4:47 consiste em pequenas porções DNA 4:50 bacteriano composta por reflexões no 4:54 Clothes não não DNA bacteriano e no 4:57 nosso também depois foi descoberto mas 4:59 tenho nós temos dessas repetições curtas 5:03 e ir essa descoberta do Cristo ela foi 5:08 começou a ser falada Tá indo em 1986 em 5:14 2010 começou a aparecer as pesquisas 5:18 sobre o Cristo e o nosso serviço nosso 5:21 serviço de imunologia da Santa Casa um 5:24 acordo de cooperação cientista nós 5:26 começamos a trabalhar com isso há cinco 5:29 anos e hoje nós temos junto com 5:31 professor da questão do é e a Fiocruz no 5:37 Rio de Janeiro nós estamos fazendo uma 5:40 uma reflexão de uma técnica utiliza do 5:43 curso opção para detecção muito mais 5:50 rápido muito mais barato por vírus 5:52 inclusive do navio dos piratas da 5:57 posição nós estamos aguardando também a 6:00 vinda bem breve do Gabriel lamont que é 6:02 um dos Mundos 6:03 A vaga é participar dessa repetição 6:11 dessa técnica do Cristo feita pelo 6:13 professor Jackson André Então o sistema 6:16 Cristo pois ele é o significa no nosso 6:22 DNA são reflexões curtas e agrupadas 6:26 regularmente na porção do DNA bacteriano 6:30 compostos de reflexões nucleotídicas 6:33 vamos até que vocês vão entender embaixo 6:35 pega uma dessas reflexões encontra-se 6:39 adjacente a um próprio espaçador 6:42 espaçador de DNA e corresponde a uma 6:46 região não purificada e ferida no DNA 6:49 bacteriano após o contato com genomas 6:53 vivas dores provenientes de vírus 6:56 bacteriófago bacteriófago e transmitir 6:59 Ou seja a detecção deste conjunto crista 7:03 quase 7:03 a receita é uma bactéria e se defende da 7:08 invasão dos bacteriófagos e é muito 7:11 interessante eu gosto de dizer que só 7:13 Deus mesmo explicaria isso a bactéria 7:16 então no seu DNA ele tem essa esse 7:19 conjunto de repetições de nucleotídeos é 7:25 e ele é capaz de induzir a formação de 7:32 uma enzima que as nozes e vai lizar o 7:37 DNA o DNA do vírus e incorpora esse 7:42 pedaço de DNA nessa essa parte de DNA ou 7:48 RNA no seu próprio DNA então eles serão 7:52 os próprios espaçadores e eles ficam 7:55 localizado adjacente a esse a esse 7:59 Cristo da bactéria 8:01 e na próxima vez essa bactéria entrar em 8:04 contacto com o vírus então o DNA dela é 8:08 capaz de detectar essa esse próprio 8:11 espaçador que tá no DNA e e que a 8:14 sequência de base por dentro do 8:17 hidrogenada do vidro e com isso ela sabe 8:19 que tá sendo agredida já tem uma memória 8:22 e ela então o DNA dela ela induz a 8:25 formação de uma rede a e vai produzir 8:29 uma enzima para realizar o vírus e as em 8:34 cima é o caso dos é muito interessante e 8:37 esse pros espaçador que é um pedaço do 8:41 RNA ou DNA do vírus ele ele não tem 8:43 penetrância por isso que é uma feijão 8:46 não pode ficante do lado dele que fica a 8:50 sequência do Cristian 8:53 E aí 8:55 e a transcrição do Bloco do pisca 8:59 resulte em pequenos fragmentos de RNA 9:01 com capacidade de desenhar o 9:04 reconhecimento de um DNA Episódio 9:07 específico e atuar com um guia de modo a 9:10 orientar anunciado caspases irá promover 9:15 a free Fire linguagem e consequentemente 9:17 eliminado DNA e vazou caso esse entre 9:21 novamente em contato com a bactéria 9:23 atuando como importante mecanismo de 9:25 defesa. DNA sem Lagoas a justamente isso 9:28 quando o princípio e tem essa repetição 9:33 de base nitrogenada e está do Lago do 9:39 RNA ou DNA depois trazido pela Caixa do 9:45 lisado pela cidade nova incorporada no 9:48 DNA da bactéria quando o vírus entra na 9:52 bactéria essa bactéria então 9:55 do do kriska ido do fragmento do RNA ou 10:00 DNA do vírus ele detecta o vírus produz 10:04 RNA e esse ganhar todas as fases 9 que 10:09 vai é destruir e subir 10:14 e o Cristian então ele é um repetições 10:19 palindrômica vou explicar vocês né 10:22 porque é isso é de pequena repetições 10:26 quando eletrônica opção em três passadas 10:30 regularmente pode tem um desenho que eu 10:32 vou explicar o Cristo é uma família de 10:36 sequência de DNA base de clonadas 10:40 encontrada no organismo procariontes do 10:43 DNA em bactérias e na área essa essa 10:48 algum tempo atrás da chave as pensar que 10:51 a porção até mais tarde que não é uma 10:54 bactéria e é muito interessante que é o 10:56 a estrutura mais antiga encontrada na 10:59 terra 11:00 o e as sequências é bons são derivados 11:05 do DNA do vírus Então essa sequência de 11:10 bases nitrogenadas que tá do lado do 11:13 Cristã ela é derivada do bacteriófago no 11:16 sector essa bactéria 11:19 bom então Cristo é capaz de detectar uma 11:22 nova invasão e capaz de produzir um caso 11:26 9 11:29 e na Idade então o Creeper sistema 11:32 crítica é um sistema imune da da matéria 11:35 do Povo carioca e confere resistência a 11:40 elementos genéticos estranho e assim 11:42 apresenta dentro do se apresenta dentro 11:45 do Anísio ou dos Fábio e fornece então 11:49 uma forma de unidade adquirida essa 11:52 bactéria 11:56 bom então quê que é uma sequência 11:58 palindromica essa essa sequência com 12:01 eletrônica ela só não existe nos isso 12:04 somente nas bactérias Não essa esse 12:07 monitor hidrônico também serve para 12:10 determinar as palavras e tem um pão 12:12 hidrônico é uma palavra ou sequência de 12:16 aminoácidos jornadas e você lendo do 12:20 início do fim ou do tempo o início é a 12:22 mesma coisa então isso aí quando você 12:25 tem o nome de uma pessoa Ana esse nome é 12:27 Tony dromico tanto faz duas ele do do 12:30 sufixo prefixo E você tem o mesmo nome e 12:34 é justamente isso que acontece nas 12:37 sequências Clone Drone cá do DNA vocês 12:40 podem ver aqui e você tem do da parte do 12:44 5 para o três linhas ou dos cinco para o 12:49 todinha eu tenho a sequência pequena de 12:52 bases nitrogenadas que elas estão G 12:56 e se e a outra gatt1 a mesma coisa tanto 13:00 faz então com isso mas você ler esse 13:03 custo esse conjunto de pequenos bases 13:07 nitrogenadas da esquerda para direita ou 13:09 da direita para esquerda essa sequência 13:12 existe também no ser humano ela fica no 13:15 DNA e do lado dela e fica aquela 13:20 sequência na bactéria e fica do lado do 13:23 PIS Portela no DNA dela aquela sequência 13:26 de bases nitrogenadas do vírus e com 13:30 isso onde esse vírus e essa sequência é 13:33 muito importante que essa sequência de 13:35 bases nitrogenadas do vírus ela não tem 13:38 que prestar atenção nessa internet 13:39 falando duas proteínas nas duas dentre 13:42 Mas ela não se ela não tem atividade 13:44 genética então o espelho e junto com é a 13:49 só sequência do vírus 13:52 e quem atividade genética que vai 13:54 detectar a nova invasão viral e será 13:57 capaz então de produzirem temas que vão 14:00 destruir o vírus outro a sequência 14:03 correta tônica que você vê a ser a e 14:06 aqui você tem a a a aqui também e te GT 14:13 e na outra na outra a faixa ttgc então 14:18 eu tanto faz eu eu ligo daqui para cá ou 14:21 daqui para lá então isso que é o que 14:22 significa o nome panetone então 14:27 terminando que o objetivo não sei se eu 14:30 estou sendo Claro é da para vocês os 14:32 fundamentos básicos essenciais da do 14:36 significado de Cristo hidratação 14:38 bacteriana sobre o vírus é com seus 14:40 postos entender tanto a a palestra do 14:44 professor Jackson Blair e opressores 14:46 aqui também eu quero deixar claro que 14:49 ele foi um dos primeiros pesquisadores 14:50 do mundo a trabalhar 14:52 E aí 14:53 o lilac eu vi também ei mandei para para 14:57 a universidade de laval na para o 15:02 laboratório dele ou Nossa coordenação 15:05 científica atual pessoais das luz ele 15:09 ficou um pelo lá na laboratório Tô tendo 15:12 é é aprendendo essa reta de utilização 15:17 do pista como terapia para você vir aqui 15:20 você tem a membrana celular da bactéria 15:22 e sempre bacteriófago ele essa tem o DNA 15:26 viral compadre a dupla e a Aqui tá o DNA 15:30 da bactéria Aqui nós temos a série A 15:33 Série crise quando a bactéria o DNA dela 15:35 ela vai produzir com as pazes e vai 15:40 utilizar especificamente aquilo que dá 15:44 ela a capacidade de colocar do lado do 15:49 da série crise cânceres esse conjunto de 15:52 base campeonatos 15:53 a ganhar do Viral isso que eu disse para 15:56 você que para vocês que a sensação aqui 15:59 é uma ação Milagrosa né como é que se 16:03 explica que ela consegue através das 16:06 caspases quebrar o DNA do vírus 16:11 especificamente trazer Para incorporar o 16:13 CD ao DNA dela essa sequência fiz um 16:16 vírus ela é que faz esse espaço né ela 16:20 não tem penetrância genética como esse 16:22 vir entrar virus entrar novamente vai 16:24 acontecer o DNA dele é sensibilizar a 16:28 bactéria ela tem aqui esse Prisma é que 16:33 tem aquela sequência que se repete tanto 16:35 da esquerda para direita e eu posso ler 16:37 mas aqui tem importante a gente colocou 16:39 no seu DNA é a sequência de bases do 16:42 Leonardo do vírus então estudar ela 16:45 agora uma mulher memória adquirida pela 16:47 não é um memory naquela foi adquirida 16:49 entrando as férias em contato com o piso 16:51 então com isso ela vai te acho 16:53 e vai produzir o dinheiro vai conduzir o 16:56 rma e vai produzir o com o complexo de 16:59 trás pago e as pás novas e vai 17:02 direcionar o tiro existe não ia ouvir 17:05 bom então isso é é o tentei espero que 17:11 eu tenha sido Claro na explicação desse 17:14 mecanismo do crisma e dos conceitos 17:17 fundamentais depois nós vamos abrir a 17:21 pergunta se eles podem perguntar e agora 17:23 eu vou voltar aperto atenção para você 17:26 só voltar a falar inglês só para para 17:28 começar o iniciar não chamar o professor 17:33 o Léo Professor Jackson Black aí o canal