Parte 3 — Jacques Tremblay — Seminário Internacional de Ciências Farmacêuticas — Método CRISPR

As manifestações associadas a Parte 3 despertam importantes questionamentos clínicos e exigem orientação especializada para evitar os riscos da automedicação ou de restrições desnecessárias. Ao abordar o tema "Parte 3 — Jacques Tremblay — Seminário Internacional de Ciências Farmacêuticas — Método CRISPR", este guia educativo reúne o conhecimento prático da equipe médica do Projeto Brasil Sem Alergia com a finalidade de esclarecer os fatores desencadeantes, os exames diagnósticos mais precisos e as estratégias terapêuticas modernas disponíveis atualmente.

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Análise Clínica e Orientação Médica sobre Parte 3

Obrigado pelo convite deixe-me começar minha apresentação usando a tecnologia crisper cast 9 a apresentação de hoje será dividida em parte primeiro apresentarei o uso do tecnologia crispr cas9 para tratar a doença diária da íris e minha pós-graduação o aluno gabriel de mart apresentará todos os derivados do crispr cas9 tecnologia pode ser usada para detectar infecção viral a palavra crispr significa repetições de penetração curta no interespaço regulatório agrupado A tecnologia crispr cas9 é derivada de pesquisas sobre bactérias, foi descoberta inicialmente em 2005 que a sequência mais nítida continha sequência viral e sim, havia uma hipótese de que crispr cas9 é o sistema imunológico bacteriano foi só em 2013 que se descobriu que o crispr cas9 pode ser usado para induzir modificação específica do genoma humano e isso começou uma grande explosão de artificial, de fato, o sistema de fundição crispr é usado por bactérias para matar bacteriófagos os bacteriófagos são extremamente abundantes, são 10 vezes mais abundante do que as bactérias e há uma guerra que está em curso entre bactérias e bacteriófagos desde milhões de anos foi inicialmente descoberto que eles estão no genoma uma sequência repetida constante pesquisadores estavam se perguntando para que serviam essas sequências repetidas e então descobriram que o sequência entre a repetição constante ou sequência que surgiram do genoma de vários bacteriófago na verdade o que normalmente acontece é quando um Bactérias infectadas por bacteriófagos normalmente as bactérias do vento bacteriófago estão mortas, mas às vezes você tem um vírus defeituoso que infecta sem matar a bactéria, mas eles então ser capaz de adquirir alguma parte da sequência do vírus e armazenará isso em seu genoma e estará pronto quando precisar desse bacteriófago novamente no futuro do dna na área crispr as bactérias irão primeiro expressar a alergia pré-cr e então haverá ser um complexo que será feito entre tracker ou cr rna e a proteína de ferro fundido esta proteína striker rna crna cas9 complexo irá então se ligar com as bactérias de hdna e induzir um corte do bacteriófago DNA para essencialmente matar o vírus para se ligar ao dna a proteína cas9 requer a presença do espaçador total motivo adjacente que é simplesmente njj para este streptococcus pyrogene então existe um crrna que contém uma sequência variável de 20 nucleotídeos que serão complementares à sequência do bacteriófago e depois há também o rastreador rna que é uma sequência de rna constante que forma um complexo com o crm quando as três partes estão juntas cr rna tracker rna na proteína cas9 o corte será induzido em exatamente três nucleotídeos é claro que, uma vez que esta é uma guerra há uma contra-medida que são tomadas pelo fago que eles vão mutam seu genoma para que se tornem resistentes e não sejam reconhecidos pelo cr rna e sobreviverá à defesa bacteriana o big bang do crispr cas9 começou em 2012, quando a geração x e seus colegas perceberam que a tecnologia de roque crispr pode permitir cortar o genoma de planetas e animais que eles também fundir seu cr rna e o rastreador rna juntos para formar um único guia rna isso foi feito essencialmente, porque o guia único rna é algo que pode ser patenteado Considerando que o crrna e o rastreador são naturais, não podem ser patenteados durante o ano seguinte houve uma explosão de artigos confirmando que a tecnologia crispr pode ser usado para cortar o genoma de bactérias células humanas carboidratos animais ratos sapos peixes-zebra plantas vôos limitou esses macacos muitos desses artigos foram publicados em revistas de prestígio como a Nature ciência natureza biotecnologia célula molecular célula molecular houve uma rápida explosão de artigo e, como você pode ver, em 26 de novembro de 2020 21 420 artigos foram publicados onde a palavra crispr é mencionada a principal razão desta rápida explosão de artigos é que custa muito menos derivar uma sequência que será capaz de cortar uma sequência específica do genoma em comparação com outras tecnologia pré-existente, como proteína de dedo de zinco e alfaiates como mencionado antes da ligação da proteína cas9 ao dna exigia a presença de um espaçador de garrafa adjacente ao conceito pam que é njj para o cas9 derivado do g cético há então a ligação também do rna guia único que reconhecerá a sequência de 20 nucleotídeos e quando o complexo é feito entre a proteína cas9 o único guia rna o dna lá é um corte que será feito a exatamente três nucleotídeos da panela uma vez dentro do núcleo, o complexo resultante travará em uma sequência curta conhecida como pan o cas9 irá descompactar o dna e combiná-lo com o rna alvo se a partida estiver completa, o elenco 9 usará duas minúsculas tesouras moleculares para cortar o dna quando isso acontece a célula tenta reparar o corte, mas o processo de reparo é propenso a erros, levando a mutações que podem desabilitar o gene que permite aos pesquisadores entender sua função essas mutações são aleatórias, mas às vezes os pesquisadores precisam ser mais precisos, por exemplo, substituindo um gene mutante com uma cópia saudável isso pode ser feito adicionando outro pedaço de dna que carrega a sequência desejada, uma vez que o sistema crispr tenha feito um corte, este modelo de DNA pode emparelhar com as extremidades cortadas recombinando e substituindo a sequência original pela nova versão uma das razões da rápida explosão é que o aumento da tecnologia de bypass também usou tudo o que foi desenvolvido pelo gene terapia nos 30 anos que a precederam temos melhor para entregar o dna usando lipossomas de polímeros catiônicos de vírus associados a aav operação eletro de microinjeção todas essas técnicas são usadas no contexto de crispr quando uma quebra de fita dupla é produzida no dna, a maioria das quebras será reparada por adjacentes não homólogos que levarão a micro deleção ou micro inserção isso é freqüentemente usado para eliminar a expressão de um gene por alterando o quadro de leitura e também pode ser reparado por reparo dirigido por homologia que requerem a presença de um DNA doador que contém sequência de homologia com o que está recuando o que está seguindo o corte e entre as duas sequências de homologia há uma sequência em azul que pode ser um único nucleotídeo ou um gene inteiro que será inserido no lado da quebra de fio duplo quando utilizamos a tecnologia crispr cas9 pretendemos produzir uma quebra de fio duplo em um local preciso no genoma humano, no entanto, o cas9 às vezes pode induzir corte em outros locais no genoma que são chamados de software de computador de mutação fora do alvo podem prever esses mutação fora do alvo usando toda a sequência do genoma humano, no entanto esses softwares não são perfeitos e às vezes imprimem fora do alvo mutação no local onde não há corte e às vezes haverá um corte no lado que não é previsto pelo computador existem ou no entanto alguns experimentos técnicas como um método guia sec que permite identificar experimentalmente os locais de mutação alvo esta técnica guidesec usou a introdução de um curto 34 base par de oligonucleotídeos no local dos cortes e posteriormente por pcr o local de inserção pode ser identificado por sequenciamento a presença dessas mutações fora do alvo é o principal problema que atrasa o uso da tecnologia crispr cat9 para correções diretas do veículo um dos métodos para reduzir a mutação alvo é simplesmente reduzir em dois ou três o número de nucleotídeos do rna guia único que está se ligando ao dna alvo outro método é usar uma nuclease cas9 mutada que corta apenas uma fita de dna.

Então chamada de rótula existe variação de cas9 onde o nikkei corta apenas a parte de baixo fita de dna e outra mutação de cas9 que permite cortar apenas a fita superior de dna só é possível induzir quebra de fita dupla no dna usando o cas9 nikkei e dois rna guia único, cada um detectando uma sequência de 20 nucleotídeos perto de entre si, também é possível usar um elenco não funcional 9 que, em seguida, elenco 9 fusível de nuclease com um nucleado, em seguida, duas áreas de ferro guia necessárias para detectar sequência que estão próximas uma da outra e as nucleas da frente precisam formar um dímero para poder cortar o dna finalmente alguns pesquisadores mutaram o gene que codifica de cas9 eles têm modificou alguma sequência codificadora de aminoácidos para reduzir a ligação entre o cas9 e o dna o gene sp cas9 é muito grande para ser inserido com um único rna guia dentro de um adeno vírus associado e, portanto, os pesquisadores identificaram cas9 de outras bactérias que são menores, por exemplo, este estafilococo provavelmente é fundido 9 é menor que o sp 9, mas tem um caminho diferente que é mais restritivo outro tipo de enzima crispr cas9 foi identificado, chama-se cpf1, produz pegajoso câncer é outro corte do dna há apenas toda uma série de vários fundidos obtidos de várias bactérias que requerem diferentes tipos de A tecnologia crisprcas9 pode ser usada não apenas para reduzir cortes no DNA, mas também pode ser usado para induzir a expressão de um gene fundindo cast 9 com bp 64 por exemplo ou ferro com caranguejo para reprimir a expressão de um gene no meu grupo de pesquisa estamos usando a tecnologia crispr cas9 para desenvolver terapias para várias doenças muita ataxia design distrofia muscular e doença de alzheimer vou apresentar isso agora inicialmente usamos a tecnologia crispr cas9 para desenvolver um tratamento para água doce táxi é uma doença adidas devido à presença de um longo tri-nucleotídeo com bgaa no íntron um dos genes fertilizantes deste repetição longa reduzem a expressão do gene da fataxina levando a problemas neurológicos e cardíacos acabamos de usar o crispr cas9 tecnologia e gerado guia único rna capaz de cortar no intron 1 antes e após a repetição do trinucleotídeo levando à sua remoção e aumentando a expressão da ataxia de fato, a remoção da repetição de trinucleotídeos nas células do yg8 modelo de camundongo sr de ataxia fredérica dobrou a expressão de fataxina em comparação com as células não tratadas e elevar a expressão de proteção para quase o nível normal o gene sp cas9 é muito grande para ser entregue com dois rna de tripa única por um único aav estamos apenas usando o gene cgcas9 menor para remover o trinucleotídeo no íntron um dos genes da fataxina usando esta nuclease cg cas9 menor também somos capazes de remover a repetição de trinucleotídeos no íntron 1 do gene da fratexina também estamos usando a tecnologia crispr cas9 para desenvolver um tratamento para duchenne distrofia muscular a distrofia muscular de duchenne é devido a mutação em um gene que codifica para a proteína distrofina é um gene grande contendo 79 éxons alguns desses éxons não contêm um múltiplo de três nucleotídeos e, portanto, setenta por cento dos casos de distrofia muçulmana de duchenne são devidos à deleção de um ou vários exões e o total número de nucleotídeos de codificação que são deletados não é um múltiplo de três por exemplo nesta apresentação temos uma deleção do exon 50 que não contém um múltiplo de três nucleotídeos isso leva a uma mudança de quadro e haverá um códon de parada no exon 51.

Assim, no início disso, a proteína distrofina é expressa, mas não no final da distrofina proteína esta situação pode ser corrigida induzindo o salto que é o remoção do exon 51 no rna mensageiro isso é feito usando oligonucleotídeo antisense este exon 51 também pode ser deletado induzindo cortes no intron 50 e na frente 51 para remover completamente que exon isso resulta na expressão do início de a proteína distrofina e do fim da proteína distrofina, mas há, no entanto, uma pequena parte da proteína que está faltando no centro da proteína a remoção de um ou vários exames completos pode assim restaurar o quadro de leitura e converter um paciente de duchene em um paciente de Becker, no entanto, alguns pacientes de apoio têm graves sintomas e são obrigados a uma cadeira de rodas aos 11 anos.

Portanto, a melhora de algumas distrofias musculares de duchenne pode não ser significativa isso ocorre, porque a proteína distrofina tem uma estrutura complexa de fato em sua parte central a proteína distrofina contém 24 repetições semelhantes a espectro cada ligadura de espectro é feita de três hélices alfa hélice a linux b e exc note que nx a está começando no lado esquerdo e elix c está terminando no lado direito e normalmente há uma sucessão de abc abc o principal problema de deletar o exame completo para restaurar a expressão da proteína distrofina é que o início e o fim da repetição do tipo espectro indicado neste esquema pelo preto seta não correspondem com o início e o fim dos exílios e, portanto, ao remover absorção completa o resultado da estrutura de repetição do tipo espectro pode não ser normal computação do vetor muscular tem uma deleção de um ou vários éxons, mas o total número de nucleotídeos de codificação que são deletados é um múltiplo de três nucleotídeos e, portanto, há sem mudança de quadro, este é o caso, por exemplo, do paciente Becker com uma exclusão do exemplo 45 para 47 ou com uma exclusão de 45 a 49 em ambos os casos, não há deslocamento de quadro O início e o fim da proteína distrofina são expressos no local de junção entre o códons restantes há uma estrutura anormal da proteína distrofina e devido a essa estrutura anormal da proteína distrofina, esses pacientes vetores estão ligados a um cadeira de rodas em tenra idade assim no meu grupo de pesquisa em vez de tentar restaurar o quadro de leitura normal excluindo exons completos, visamos produzir um exame evaline 5054 que não apenas restaura o quadro de leitura normal, mas exige uma proteína distópica com um estrutura normal, fizemos nossos experimentos iniciais usando o mioblasto de um paciente duchenne com deleção do exame 51 52 e 53.

Assim, porque o número de nucleotídeos de codificação não era um múltiplo de três, havia um códon de parada no exame 54 devido ao deslocamento do quadro, acabamos de usar um cas9 mais nítido tecnologia para induzir um corte no exon 50 e um corte no exon 54 para criar o exame e-braid 50-54 para produzir este exame de imigração identificamos inicialmente quais são os possíveis sp cas9 pam ou qual outro local onde podemos cortar no exon 50 e no exon 54 identificamos 10 locais de tempo no exame 50 e 14 tamanhos de bandeja diferentes no exon 53.

Esta tabela prevê quais são os resultados da indução de cortes no exame 50 e no exame 54. Quando temos um quadrado azul significa que o cut foi produzido no exon 50 logo após os três nucleotídeos e pede um aminoácido e o corte foi produzido no exon 54 logo antes dos três nucleotídeos que codificam um aminoácido, portanto, no ponto de junção, temos o amino ácidos que são um escoltado pelo exemplo 54 seguido imediatamente por um aminoácido codificado pelo exemplo, não há amizade e não há produção de novo aminoácido, porém quando a praça está limpa isso significa que temos no entroncamento local um novo aminoácido que é produzido, porque somos cortados no exon 50 logo após um dos nucleotídeos do códon e os dois nucleotídeos que irão completar esses códons são exóticos antes de cortarmos logo após um nucleotídeo do códon no exame 54 e, portanto, primeiros dois nucleotídeos à esquerda para criar um novo códon no local de junção, há apenas um novo aminoácido no local de junção, mas não há mudança de quadro e todos os outros aminoácidos são os corretos também é possível com este quadrado em vermelho ter um novo códon produzido no lado da junção, mas esse novo códon é um códon de parada não é real, queremos fazer todos os quadrados de largura, porque há uma mudança de quadro que estamos cortando após um nucleotídeo do códon no exon 15 e estamos cortando antes do último nucleotídeo do cooldown no exame 54 e, assim, adicionamos a junção lado há um novo códon que é feito, porque há uma mudança de quadro e todos os aminoácidos a seguir não são os corretos temos testadores de poeira lá sua esfera de guia ironia um guia ironia cortando na zona 50 e o outro corte de engomar guia no exon 54 isso produziu um exame ibrit 1554 que tinha o tamanho previsto para este exame híbrido, observe que quando estão fazendo cortes no exame 50 e no exon 54 em uma distrofina normal estamos excluindo 160.000 pares de bases e apesar disso a junção entre exon 50 e 54 é do tamanho previsto temos sequência este exame de elite que foi produzido por corte no exon 50 e no exon 54.

Não só o exame eblid era exatamente do tamanho previsto, mas a sequência também foi exatamente como previsto, por exemplo, tivemos um local de junção o fusões do exon 50 e do exemplo 54 produzindo exatamente o amino previsto ácido também obtivemos no sítio de junção um novo códon codificando para o predito aminoácido ou codificação para um códon de parada e às vezes como previsto pelo branco quadrado, tivemos uma mudança de quadro e quando houve uma mudança de quadro, houve cooldowns de stubs que foram atendidos nos exames resultantes como mencionado anteriormente a proteína distrofina contida em sua parte central 24 do espectro como repita cada um sendo feito de três hélices alfa a b e c acabamos de usar um guia rna para induzir um corte no exon 50 em uma sequência que codifica para lxc e outro rna guia induzindo um corte no exon 54 também em uma sequência que codifica a hélice c a evidência resultante exon 5054 pede um ibrahim alex c onde o início de nxt é codificado pelo exon 50 e o final de lxc é codificado pelo exon 54.

Esta é uma estrutura que foi computador previsto usando a sequência da proteína resultante quando o biovidro dessa paciente de duchenne teve uma deleção do exame 51 a 53 são fundidos para formar algumas pequenas fibras musculares e cultura chamada miotubos, na verdade, esses músculos fibras não expressam distrofina, porque este é um paciente de vergonha, porém o mioblasto de um humano saudável, quando se fundem, formam um pequeno biotubo e expressam isso tópico como pode ser visto aqui neste sangue ocidental quando usamos o bioblasto da duchenne paciente e induzimos a formação do exame de ignição 50-54 temos expressão da proteína distrofina em cultura e como você pode ver esta proteína distrofina tem um peso molecular menor do que a distrofina normal, porque há deleção do exon 51 a 53 e uma exclusão adicional de parte do exon 50 parte do exame 54, portanto, há uma parte da proteína distrofina que está ausente e é por isso que a proteína é menor, mas, no entanto, é expresso para nossos experimentos iniciais in vivo usamos o modelo de camundongo hdmd este é um camundongo transgênico que expressou o gene da distrofina humana todos os íntrons em todos os éxons nós eletroporamos no músculo deste revestimento de plasmídeo de camundongo para o sp cas9 combustíveis com a proteína verde fluorescente e dois rnas únicos guia este um mês depois quando tiramos o músculo havia expressão do verde proteína fluorescente confirmando que o plasmídeo foram eletroporados corretamente nas fibras musculares levando à expressão do proteína verde fluorescente e provavelmente também levando à expressão do sp ferro fundido e depois de dois deslizes, extraímos o dna desses músculo e primeiro confirmamos usando um teste chamado de enzima que, de fato, eles estavam sendo constantemente produzidos nos exames 50 e 54.

Use pcr para amplificar o ebrade exon 5054 observe que nos músculos que não são tratados com a tecnologia crispr cas9 não há amplificação do exemplo 5054, porque há 160.000 pares de bases entre esses dois exons e, portanto, os dois primers para o pcr são muito separados um do outro nós então sequenciamos este exon 5054 que foi produzido in vivo no músculo do camundongo expressando o gene da distrofina humana e como previsto tivemos a sequência de exon 50 e um novo códon no sítio de junção seguido por todos os códons corretos que codificam para o aminoácido normal no exon 54.

Isso é exatamente como previsto in vivo no entanto, para uma entrega do gene cas9 in vivo para vários músculos precisamos usar um vírus adeno associado como mencionado antes do sp cas9 g é muito grande para ser entregue com ironia de dois guias por um único aav e, portanto, usamos para nossos próximos experimentos o elenco 9 do staphylococcus moleus que é um cas9 menor que permite a entrega com dois rna guia por um único avp neste caso utilizamos uma guia rna que realiza cortes no exon 47 em uma sequência que codifica para elix b e no exon 58 em uma sequência que codifica novamente para elix b isso resultou na formação de um ebola exoma 4758 codificação para um ibrigid hxb que tem uma estrutura normal o início do lxb sendo codificado pelo exon 47 e o fim desse mal ser codificado pelo exon 58 então usamos para nosso experimento indiv um novo modelo de mouse chamado hdmp delta ii é o mesmo modelo de mouse que anteriormente que contém o gene da distrofina com todos os éxons e todos os íntrons, exceto aquele este camundongo tem uma deleção do exame 52 e, portanto, não há expressão do gene distrofia humano usamos assim a tecnologia crispr cas9 para induzir um corte no exon 47 e um corte no exame 58 produzindo o exame eberlini 4758 resultando na produção de uma proteína distópica contendo um exemplo de ibrite em lxp injetamos nesses hdmd delta 52 codificação do mouse aev para sc cast 9 e 2 single guide rna um mês depois observamos no músculo a expressão do gene da distrofina humana incluindo no coração estamos apenas propondo um tratamento de distrofia muscular de duchenne que seria a entrega sistêmica por um vírus adeno associado da classe 9g e de dois guia rna para formar qualquer exame de pão em contraste com salto de exame que é um tratamento feito no nível da mensagem rna o tratamento que nós propor ao nível do dna seria permanente a tecnologia crispr cas9 está evoluindo rapidamente e novas tecnologias derivadas do crispr cas9 permite agora a modificação de um único nucleotídeo mais de 32.000 modificações de um único nucleotídeo são responsáveis ​​por ouvindo doença constante e, portanto, a capacidade de corrigir um único nucleotídeo forneceria tratamento para a maioria dessas doenças estáveis ​​em cura o primeiro tratamento que permite a modificação de um único nucleotídeo foi desenvolvido por comando em 2017 que usou uma capa de joelho cas9 que é a classe modificada cas9 que é capaz de cortar apenas um fio de dna e este estojo fundido 90 é fundido com acetidina desaminase esta tecnologia de forma impermanente clinicamente modificar o city bean em um uvd que é substituído por um tempo de reparo do DNA a principal limitação dessa técnica é a modificação química da vontade ctd ocorrem em uma janela estreita localizada em 12 a 16 pares de bases do ngg pan usamos inicialmente a edição base tecnologia para desenvolver um tratamento para a doença de Alzheimer a doença de Alzheimer é produzida por um metabolismo anormal da munição proteína normalmente esta proteína é cortada pelos secretários alfa seguido por um corte pelas simetrias gama que produzem peptídeos e proteínas fragmentos que são degradados sem causar nenhum problema, porém esta proteína também pode ser cortada por a sequência beta seguida por um corte pelos secretários gama e isso produziu peptídeos medianos beta longos de 40 42 aminoácidos que agregam-se uns aos outros formando aminoácidos que interferem nas transmissão levando à morte do neurônio e os problemas de memória este esquema ilustra a sequência de aminoácidos da parte transmembrana do proteína de repressão anaeróbica podemos ver a posição do beta alfa e gama separa fora de todos os aminoácidos a estrela acima de sua nome são aminoácidos que são quantificados levando à família da versão da doença por favor observe a posição com a seta vermelha esta é a alanina na versão 673 quando esta adenina é alterada por vale, isso leva a doença de Alzheimer de início precoce grave e você são azamara aos 40 anos.

Porém quando esta adenina é 105 anos como mostrado por johnson nepal na natureza 2012. A presença da mutação a673t também conhecida como a mutação islandesa mutação reduzem a secreção de um beta 40 em nosso peptídeo beta 42 para o tipo selvagem eppg e para appg contendo a mutação london nossos experimentos mostraram que a presença da mutação a673t reduzir a secreção de um peptídeo beta 40 e beta 42 pelo epp genes não apenas para o gene do tipo selvagem, mas também para genes app contendo vários genes familiares.

Mutações da doença de Alzheimer como mencionado antes da tecnologia de edição base crispr cas9 permitir modificar a cidade em um tempo acabamos de usar a tecnologia de edição básica para atingir o citoplano na fita antecedente do códon alanina transformando essa citodina em um e apenas mudando o códon de alanina em um triângulo o principal problema com esta abordagem é que, embora queiramos modificar a citodina na fita descendente final do códon de adenina existem outros nucleotídeos de acidez próximos que também são afetados pela abordagem de edição básica construímos 14 enzimas de edição de base diferentes para poder modificar mais especificamente no cooldown anti-sentido da anatomia modificando a cidade e o códon antisense do led, conseguimos introduzir o h673t mutação em até 17 do avpg no entanto outras cidades também localizadas no estrato antecedente também foram modificadas por essa abordagem uma nova tecnologia fantástica chamada privada foi recentemente desenvolvida pela enceladus com licenças em princípio para substituir qualquer nucleotídeo por qualquer a outra tecnologia de edição usa um decaimento cas9 fundido com um reverso transcriptase também requer um guia de edição principal rna conhecido como remédio para porco o peg rna é essencialmente um único guia rna prolongado, porque como um único guia rna contém uma sequência espaçadora que reage com 20 nucleotídeos no dna de destino, ele também contém o andaime constante do único guia rna que está em vermelho e, em seguida, em sua extremidade uh cinco primo há um prolongamento com o lado de flexão do primer que é uma sequência de 10 a 17 nucleotídeos reagindo com a fita superior do dna isso é seguido pelo modelo de transcriptase reversa novamente, que é de 10 a 17 nucleotídeos em comprimento e que conterá algum nucleotídeo modificado em vermelho neste caso indicando qual nucleotídeo deve ser modificado pela transcriptase reversa um plasmídeo projetado por anzalone em tudo está disponível no edgy para construir um novo peg rna este colega de classe contém um gene de proteína fluorescente vermelho que pode ser removido por cortes bsa1 que produzir uma espinha dorsal da proteína e, em seguida, os outros componentes são o primer espaçador que liga o lado inverso modelo de transcriptase e o bisturi de RNA de porco, todas essas sequências são únicas oligonucleotídeo de fita que pode ser adquirido da idt essas quatro partes são então montadas juntos para produzir um novo pegaron para usar a tecnologia de edição principal, primeiro temos que identificar a guia adjacente do espaçador de fotos que é njj para o elenco nove de streptococcus pyrogene isso permitirá que o cas9 se ligue ao dna, então a sequência espaçadora do peg rna se ligará a uma sequência de 20 nucleotídeos de dna, neste caso a fita inferior e a formação do complexo entre os decaimentos do peg rna classe 9 e o dna induzirá o corte a exatamente 3 nucleotídeos da panela e a fita superior do dna isso liberar a fita superior de dna para poder interagir com o lado de ligação do primer de o peg rna e, em seguida, o modelo de transcriptase reversa que continham poucos nucleotídeos a serem relacionados estarão disponíveis para o transcriptase reversa para sintetizar uma nova fita superior de DNA muitos pacientes com distrofia muscular de duchenne têm um dmdg de códon de parada, pois não tivemos acesso às células do paciente contendo tal apontamento decidimos introduzir estas paradas códons usando a principal tecnologia de edição, então em cada caso tínhamos que identificar um ngg identificar a sequência do protoespaçador peg rna e, em seguida, modificar a sequência inversa modelo de transcriptase para entrar para modificar um códon para um aminoácido em um acionista, neste caso, mudamos para apresentar o material tga usamos com sucesso essa abordagem para introduzir o exame de códon de atordoamento 9 20 35 42 55 e 61.

Acabamos de projetar vários rna de porco direcionados ao dmd exon 35, como você pode ver variamos o modelo de transcriptase reversa em azul de 10 a 16 nucleotídeos e também variamos o sítio de ligação primária em verde de 10 a 15 nucleotídeos e no local de mutação desejado que introduzimos em introduzir essa mutação nossos experimentos iniciais foram feitos em células hgk 293 tentamos reproduzir a mutação de mx1g e direcionar dmd exon 35.

Então, essencialmente, essas células foram transfectadas com codificação de plasmídeo para o cas9 djs se funde com os dias de transmissão reversa e um rna pago visando o exon 35 do gene dmd ou o gene emh one o dna foi extraído três dias depois e a sequência alvo foi amplificada por pcr e sequenciada usando o método central a sequência foi analisada usando o programa online edit r essencialmente observamos uma mutação de correção 32 do gene air x1 como feito apenas por cabeças, no entanto, para a mutação do exon 35 tivemos um fundo 2 na sequência do controle negativo controle e com os diferentes peg rna temos mutação variando de quatro a oito por cento, então isso não foi tão bom quanto para o e mx one g acabamos de tentar métodos diferentes para tentar aumentar a porcentagem de edição do genoma do exon 35.

O primeiro método que tentamos é repetir o tratamento três vezes essencialmente as células foram transfectadas com plasmídeo no dia 0 6 12. E o DNA foi extraído três dias e seis dias após cada tratamento amplificamos o exon 35 pcr em cada uma das datas de extração e sequencie-o por sequência do remetente e do analisador, pois você pode ver a porcentagem do genoma edição aumentou do dia 3 para o dia 18 com o tratamento repetido e este foi o caso de todos os três peg rna que visavam testamos então um segundo método para tentar aumentar a porcentagem de mutação no exon 35.

É para induzir uma segunda escavação no gene alvo este é o método pe3 essencialmente, identificamos duas sequências pam que permitiram ao kite rna induzir um segundo corte e 57 nucleotídeos do original grande nome celestial ou em 24 cleotide do rebanho pagão quando induzimos uma segunda etapa às 24 horas nucleares ou em 57 nucleotídeos induzidos pela alergia ao peg houve um aumento significativo na adição do gene alvo para ferro-gusa nos 35 4 e pig rna 256, mas não para maior e e35 você ainda tem que entenda, porque um terceiro método para melhorar a porcentagem de mutação no gene alvo é mutar a panela usada pela harmonia de peg acabamos de projetar rna de porco que não só foi capaz de introduzir um códon de parada mutação, mas também somos capazes de mutar simultaneamente a panela e o uso mutação do pan usado pelo peg rna melhora a porcentagem de mutação em o códon de parada para dois dos três peg rna que nós testei combinando os dois métodos que estão induzindo um segundo corte no alvo g e a mutação do pan usado pelo peg rna aumenta ainda mais a mutação do dmd exon 35 a 39 com todos os três pinos que temos testado, estamos iniciando um novo projeto para corrigir a mutação responsável por outra doença estável, estamos trabalhando na fibrose cística devido a mutação no canal de cloreto cftr em músculo congênito distrofia por mutação no receptor de reanodina e em ataxia 8 devido a mutação no gene nkx6 tipo 2 para cada período doença constante devido a uma mutação pontual, por exemplo, aqui com ataques em tipo 8 é possível corrigir em princípio o gene mutado usando a edição prime tecnologia neste caso aqui podemos identificar que a mutação é uma mudança de adenosina para o tempo e assim podemos identificar um pam njg para o ferro fundido sp que está próximo ao nucleotídeo mutado podemos então projetar um plano rna que irá introduzir a mutação desejada neste caso estamos introduzindo duas mutações uma para corrigir a mutação para reverter a timodina em uma adenosina e a segunda mutação do ponto médio é modificar o caminho para que, após a correção, a enzima cad9 não possa mais se ligar a as tecnologias derivadas do dna crispr cas9 podem não ser usado para tratar muitas doenças individuais, o principal problema continua sendo o inibidor entrega dos agentes de edição Obrigado pela sua atenção ok obrigado professor jax uh vou aproveitar a vez para fazer um comentário geral para quem não fala uh quem não fala inglês ok obrigado pela sua apresentação obrigado, claro.

Via Aérea Unificada: Manejo da Rinite, Rinossinusite e Hipersensibilidade Nasal

Inflamação da Mucosa Respiratória, Ácaros Domiciliares e Complicações Locais

Sob o conceito médico de 'via aérea única', a inflamação não controlada das cavidades nasais e dos seios paranasais repercute diretamente nos ouvidos (disfunção tubária), nos olhos (rinoconjuntivite), na qualidade do sono e nos brônquios. Em subgrupos específicos, como na Doença Respiratória Exacerbada por Aspirina (DREA), soma-se a polipose nasal recidivante, a asma e a intolerância aos anti-inflamatórios inibidores da COX-1, exigindo diagnóstico especializado para restaurar o olfato e a patência respiratória.

Lavagem Nasal, Sprays Tópicos Seguros e Imunoterapia Dessensibilizante

A lavagem nasal diária com solução salina isotônica remove mecanicamente alérgenos, poluentes e mediadores inflamatórios, potencializando a ação tópica segura dos sprays prescritos (aplicados sempre direcionando o bico para a parede lateral do nariz, longe do septo). Para ir além do alívio paliativo, realizar o teste de alergia permite estruturar o vacina para rinite definitivo com vacina para alergia, único recurso capaz de reeducar a resposta imunológica frente aos alérgenos respiratórios.

Reações Imediatas, Farmacodermias Tardias e Riscos da Automedicação

As reações de hipersensibilidade a fármacos abrangem mecanismos imunológicos e farmacológicos distintos: desde reações imediatas (até uma a seis horas após a dose, manifestadas por urticária, angioedema labial ou palpebral, broncoespasmo e anafilaxia, comuns com analgésicos inibidores da COX-1 e betalactâmicos) até farmacodermias tardias mediadas por células T, como exantemas maculopapulares e a síndrome DRESS — condição sistêmica que surge semanas após o início de anticonvulsivantes, sulfonas ou alopurinol, cursando com febre, linfonodomegalia, eosinofilia e necessidade de suspensão imediata sob supervisão hospitalar.

Prevenção Ambiental, Adesão Terapêutica e Monitoramento Contínuo

O sucesso a longo prazo no manejo das condições alérgicas e imunológicas depende diretamente da aliança entre tratamento médico direcionado e medidas educativas cotidianas. Manter ambientes bem ventilados e livres de acúmulo de poeira doméstica, preservar a hidratação fisiológica das mucosas e da barreira cutânea, respeitar rigorosamente os horários e a técnica de uso das medicações preventivas prescritas e realizar revisões periódicas permitem estabilizar a inflamação subclínica antes que ela evolua para exacerbações agudas.

Critérios de Segurança Clínica e Sinais de Alerta em Alergologia

Reconhecer precocemente os sinais de alerta que exigem reavaliação médica prioritária faz parte da educação em saúde de todo paciente e familiar. Sintomas como dispneia progressiva (dificuldade para respirar ou falar frases completas), chiado torácico refratário, edema súbito de lábios, língua ou glote, tontura por queda pressórica, febre persistente associada a lesões de pele ou acometimento de mucosas demandam atendimento imediato de urgência, seguido de investigação alergológica estruturada para prevenir recorrências futuras.

Impacto na Qualidade de Vida, Sono e Bem-Estar Sistêmico

Além das manifestações físicas diretas, quadros não controlados ligados a Parte 3 interferem profundamente na arquitetura do sono reparador, na capacidade de concentração escolar e profissional e no equilíbrio emocional. O estresse crônico, por meio de mediadores neuroendócrinos e alarminas epiteliais, retroalimenta a resposta inflamatória imunitária. Dessa forma, instituir uma abordagem integral de reabilitação clínica e ambiental restaura a autonomia diária e o bem-estar global do indivíduo.

Importância do Diagnóstico Diferencial e da Anamnese Detalhada

Na especialidade de Alergia e Imunologia, dois pacientes com sintomas aparentemente semelhantes envolvendo Parte 3 podem apresentar mecanismos fisiopatológicos completamente distintos. Por essa razão, a história clínica minuciosa — investigando cronologia das crises, ambiente domiciliar e profissional, histórico familiar de atopia, uso de fármacos concomitantes e hábitos alimentares — funciona como bússola indispensável para interpretar corretamente exames laboratoriais (como dosagem de IgE total e específica) e provas funcionais. Um resultado laboratorial isolado jamais substitui o julgamento clínico presencial ou por telemedicina especializada, prevenindo diagnósticos equivocados e tratamentos desnecessários.

Perguntas Complementares Frequentes na Prática Clínica

Reações Imunológicas a Picadas de Insetos e Prevenção de Crises: Na prática alergológica, distinguir um edema inflamatório local de uma reação alérgica sistêmica é decisivo para proteger a vida do paciente. Na hipersensibilidade a mosquitos, ocorre resposta imune mista (imediata mediada por IgE e tardia celular por linfócitos T), fazendo com que uma única picada reative lesões antigas pelo corpo. Já nas reações a abelhas e marimbondos, sintomas à distância do local da ferroada — como placas generalizadas, rouquidão, broncoespasmo ou queda de pressão arterial — caracterizam anafilaxia e demandam conduta imediata.

Mecanismos da Alergia Alimentar, Diagnóstico Preciso e Manejo Nutricional: Na alergologia contemporânea, é essencial diferenciar a reação imunológica contra proteínas alimentares — como caseína, alfa-lactoalbumina e beta-lactoglobulina no leite de vaca, ovomucoide no ovo ou tropomiosina nos crustáceos — das intolerâncias digestivas não imunes, a exemplo da deficiência da enzima lactase. Enquanto a intolerância provoca distensão abdominal, flatulência e diarreia osmótica restritas ao tubo digestivo, a alergia alimentar envolve linfócitos Th2 e anticorpos IgE ou inflamação celular eosinofílica, podendo causar urticária aguda, angioedema, broncoespasmo, proctocolite ou anafilaxia em minutos após a ingestão de traços.

Imunologia da Mucosa Digestiva: Eixo Intestino-Vias Aéreas e Diagnóstico Diferencial: O equilíbrio entre a microbiota comensal e a mucosa digestiva regula diretamente a tolerância imunológica sistêmica. Proteínas como a gliadina podem modular a liberação de zonulina em indivíduos geneticamente suscetíveis (portadores de alelos HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 na doença celíaca), ampliando a permeabilidade intestinal e perpetuando cascatas inflamatórias locais e extraintestinais. A distinção criteriosa entre autoimunidade celíaca, alergia ao trigo IgE-mediada e fermentação de carboidratos Fodmaps evita condutas inadequadas.

Saúde da Barreira Cutânea, Inflamação Imunológica e Controle do Prurido: A pele atua como o primeiro órgão de defesa imunológica do organismo humano. Na dermatite atópica, alterações genéticas em proteínas estruturais do estrato córneo (como a filagrina) e na composição de ceramidas provocam perda transepidérmica de água, ressecamento acentuado e entrada facilitada de ácaros e aeroalérgenos. Esse microambiente ativa citocinas do perfil Th2 (especialmente IL-4, IL-13 e IL-31, diretamente ligada ao prurido intenso) e favorece a colonização pelo Staphylococcus aureus, cujos superantígenos perpetuam as crises eczematosas.

Imunologia das Doenças Autoimunes Cutâneas e Cuidado Integrado: Na interface entre a Imunologia Clínica, a Dermatologia e a Reumatologia, avaliar o paciente de forma sistêmica permite reconhecer precocemente comorbidades metabólicas, articulares e eventuais hipersensibilidades coexistentes. Exames como o Fator Antinuclear (FAN) e provas inflamatórias atuam como ferramentas de triagem que só adquirem significado diagnóstico real quando interpretados à luz do exame físico detalhado da pele, unhas, couro cabeludo e articulações.

Fisiopatologia das Urticárias e do Angioedema: Diagnóstico e Controle Seguro: As urticárias caracterizam-se pelo surgimento súbito de urticas (pápulas eritematosas e edematosas intensamente pruriginosas e fugazes, que desaparecem em menos de 24 horas no mesmo ponto sem deixar cicatriz), podendo acompanhar-se de angioedema nas camadas profundas da derme e submucosa. Nos quadros agudos (duração inferior a seis semanas), infecções virais, alimentos e medicamentos figuram entre os gatilhos clássicos; já na urticária crônica espontânea ou nas urticárias induzidas (dermográfica, colinérgica pelo suor/aquecimento, ao frio ou à pressão tardia), mecanismos autoimunes ou de hiper-reatividade mastocitária assumem papel central.

Controle da Inflamação Brônquica, Função Pulmonar e Prevenção do Remodelamento: O monitoramento objetivo por meio da espirometria (prova de função pulmonar com teste broncodilatador) é indispensável mesmo nos períodos em que o paciente acredita estar assintomático, pois detecta obstruções silenciosas em pequenas vias aéreas. Os corticoides inalatórios modernos atuam diretamente na mucosa respiratória em doses medidas em microgramas, oferecendo elevada segurança sistêmica, reduzindo exacerbações graves e protegendo a capacidade respiratória a longo prazo.

Segurança Farmacológica, Reações Adversas a Medicamentos e Uso Racional de Corticoides: Outro ponto crítico de farmacovigilância diz respeito ao uso indiscriminado de corticoides sistêmicos orais ou injetáveis de depósito de longa ação (como associações de betametasona intramuscular). Embora promovam alívio rápido aparente, aplicações repetidas suprimem o eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal, elevam a pressão arterial e a glicemia, desmineralizam a massa óssea, fragilizam a imunidade contra infecções e podem provocar dor neuropática local quando aplicadas inadequadamente na região glútea.

Imunização Segura, Resposta Imunológica e Proteção do Paciente Alérgico: A imunização preventiva representa uma das maiores conquistas da medicina para reduzir hospitalizações e complicações infecciosas graves, especialmente em portadores de doenças respiratórias crônicas (como asma e DPOC), cardiopatias, hipertensão arterial e diabetes. Pacientes alérgicos a aeroalérgenos, alimentos ou medicamentos comuns não possuem contraindicação geral às vacinas; a atenção alergológica concentra-se na avaliação específica de raros casos de anafilaxia prévia a componentes isolados da fórmula (como polietilenoglicol, polissorbato ou traços proteicos específicos), situações que hoje contam com protocolos seguros de aplicação assistida.

Medicina de Precisão: Como Funcionam os Anticorpos Monoclonais e Imunobiológicos: A escolha do imunobiológico ideal exige fenotipagem e endotipagem rigorosas pelo médico especialista, avaliando biomarcadores sanguíneos (contagem de eosinófilos periféricos, níveis séricos de IgE total e fração exalada de óxido nítrico) e comorbidades coexistentes, como asma grave, polipose nasal, urticária crônica espontânea refratária e dermatite atópica moderada a grave. As aplicações subcutâneas seguem cronograma regular sob supervisão assistencial segura.

Conclusão e Síntese das Orientações

Conclui-se que o manejo eficiente das questões relacionadas a Parte 3 apoia-se na união entre informação científica de qualidade, prevenção ambiental e terapêutica direcionada ao perfil de cada paciente. Diante de sintomas persistentes ou recorrentes, buscar avaliação com médico Alergista e imunologista — integrando investigação diagnóstica criteriosa e opções consolidadas de cuidado especializado em alergia e imunologia sempre que indicadas — garante segurança clínica e proteção duradoura da saúde.