Parte 5 — Gabriel Lamothe — Seminário Internacional de Ciências Farmacêuticas — Método CRISPR

Avaliação Alergológica e Resposta Clínica Fundamentada

Bem-vindo obrigado por me receber uh vamos ver se podemos começar oi meu nome é gabriel lamot e hoje eu estarei discutindo a detecção de cyrus kobe sim, isso é muito melhor é o som melhor agora b2 usando tecnologia crispr oh perfeito é o teste que estamos desenvolvendo no laboratório do dr tremblay estudos confirmaram que muitos indivíduos infectados com o vírus sars kobe 2 são portadores assintomáticos do vírus isso é problemático, pois a pandemia pode estar crescendo sem supervisão adequada, simplesmente concentrando os testes em indivíduos com sintomas em oposição a populações inteiras não é suficiente para melhor conter o vírus até que uma distribuição em larga escala de uma vacina eficaz esteja em andamento em larga escala e teste contínuo é obrigatório o pipeline de diagnóstico atual para detectar sars cov2 é um processo de três etapas, o primeiro passo é obter swabs nasofaríngeos de pacientes o próximo passo é isolar o rna total das referidas amostras e fornecer o rna necessário para isso terceiro passo, que é usar máquinas de videogravador quantitativo em tempo real, o rna é primeiro transcrito inversamente em dna e, em seguida, amplificado, um corante é adicionado à reação de amplificação para sinalizar a presença de dna fitas após um certo número de ciclos de amplificação, um resultado positivo dará um sinal forte o suficiente para que a máquina o sinalize como contendo o vírus original agora esse processo é problemático para um algumas razões, a primeira é que as máquinas de PCr em tempo real são extremamente caras a maioria pode variar de 15.000 dólares americanos a mais de 90.000 dólares americanos dado que é um equipamento bastante especializado e que nem todos os laboratórios de biologia molecular precisam de um alguns se dão bem com uma máquina de pcr comum que custa 5000 dólares muito mais razoáveis como tal teste generalizado para os coronifiers usando essas máquinas não é ideal adquirir o grande número de máquinas necessárias para testes generalizados é uma façanha por si só e é provavelmente um dos fatores que contribuem para os longos tempos de espera por resultados muitos relatos afirmaram que pode levar de 3 a 24 horas ou mais para obter resultados em uma clínica laboratório de diagnóstico aqui no Canadá ontário relata tempos de espera de até quatro dias para obter resultados áreas metropolitanas de alta densidade, como Nova York, também estão sujeitas a longas filas para testes e, em seguida, um tempo para resultados de cerca de sete dias para algumas clínicas daquela cidade a criação de novos tipos de testes de detecção é, portanto, um passo importante para conter a propagação deste vírus, um teste ideal precisa seguir o mundo os critérios da organização de saúde para garantir que é o teste precisam ser acessíveis para o maior número possível de pessoas em risco de infecção testes que exigem reagentes ou máquinas extremamente caras não são ideais o teste também deve ser específico para evitar falsos negativos dessa forma qualquer pessoa quem pode potencialmente espalhar o vírus pode ser identificado e colocado em quarentena o teste deve ser sensível para que poucas pessoas que não tenham o vírus sejam rotuladas erroneamente como tendo e tratadas inadequadamente o teste também deve ser amigável ao usuário, ou seja, deve ser simples de executar e deve ser rápido e robusto, ou seja, deve dar um tempo aos resultados que seja rápido o suficiente para aproveitar ao máximo as situações de resultados em que pode levar até sete dias para obter resultados estão claramente longe do ideal, pois no momento em que o paciente recebe a informação que eles podem ter infectado muitos outros o teste deve ser livre de equipamentos tanto como possíveis testes que exigem muitas máquinas raras e caras não são ideais para muitos países, finalmente, o teste deve ser entregue a quem precisa a descoberta do cast 13 ou c2 c2 foi revolucionária no campo da detecção molecular este efetor crispr classe 2 tipo 6 é semelhante à proteína lançada 9 fora de qual terminação base e terminação prime foram projetadas esta proteína também é um membro da família crispr ao contrário do cas9, no entanto, o cast 13 pode ser programado para direcionar rnas em oposição a dnas ao se ligar ao seu crispr rna cas13 é preparado para direcionar sequências de rna extremamente específicas após localizar um alvo sequência a proteína cast 13 é ativada, isso faz com que a proteína comece a clivar tudo ao seu redor em um evento chamado clivagem colateral ele cliva seu alvo original e, em seguida, passa a começar a clivar todos os pesquisadores de rnas ao redor perceberam que isso clivagem colateral poderia ser usada para transformar a proteína em um interruptor para um teste de detecção uma vez a molécula alvo está presente o interruptor é acionado o cast cas13 ativado e todos os rnas circundantes são degradados por marcando certos rnas na solução com uma molécula fluorescente e um supressor seria, portanto, possível resolver um sinal que os pesquisadores começaram a desenvolver um teste de detecção baseado nesta proteína para vírus, bactérias e doenças humanas, como câncer no entanto, eles logo notaram que havia certas limitações para a proteína e que a detecção limitada estava longe de ser sensível suficiente para suas necessidades, recentemente, alguns testes foram projetados usando apenas cast 13 no entanto, esses testes são menos sensíveis e tendem a usar uma proteína cast 13 diferente pesquisadores do amplo instituto decidiram complementar a proteína com algumas outras que amplificariam a direcione o rna para este fim dr zhang e sua equipe criaram um novo teste chamado de alta sensibilidade específica desbloqueio de repórter enzimático ou sherlock para abreviar este teste é baseado na transcrição reversa do rna alvo em dna depois o dna é amplificado em um temperatura constante usando um processo chamado amplificação da polimerase recombinase esta técnica amplifica uma pequena quantidade de dna a uma temperatura constante ao contrário do bcr mais comumente usado a incorporação desta etapa também significa que o teste de detecção que se segue pode direcionar o dna desde que a reação rpa simplesmente amplifica uma determinada seção de dna usando dois primers, a sequência genética inicial pode ser rna ou dna, desde que as enzimas transcriptase reversa estejam presentes para o rna as sequências amplificadas são então transcritas usando uma t7 rna polimerase para criar grandes quantidades do alvo rna isso permite que o cas13 tenha um pool muito maior de moléculas-alvo que pode ativar a enzima, uma vez que a enzima está ativa, ela faz o que discutimos antes e começa a clivar todos os rnas circundantes, incluindo os rnas repórteres, que emitem o sinal facilmente detectável que faz o teste funcionar em sua versão inicial do sherlock test dois repórteres diferentes moléculas foram usadas o primeiro usou uma molécula fluorescente, bem como um supressor e foi capaz de produzir muita fluorescência após a clivagem do rna o outro foi projetado para interagir com alguns anticorpos e quando foi clivado apareceu como um segunda banda em uma tira que era bastante semelhante a um teste de gravidez embora esse teste tenha sido bom em muitos aspectos, ele teve algumas desvantagens no início da pandemia, tentamos replicá-lo e imediatamente teve alguns problemas, o maior problema de longe foi que alguns dos materiais necessários para o teste para trabalhar só estavam disponíveis em oferta extremamente limitada os kits necessários para realizar rpa reações, por exemplo, levaram aproximadamente dois meses para chegar e mesmo assim só recebemos o suficiente materiais para realizar 200 testes, isso claramente não seria suficiente para produzir testes suficientes no futuro, além disso, o repórter que usou uma tira estilo gravidez foi notável e parecia ser muito útil no entanto, uma vez que era muito difícil adquirir quantidades insuficientes decidimos não usá-lo e, em vez disso, concentrar nossos esforços no uso do repórter de estilo fluorescente rna desde a versão original do teste não pôde ser usado por nós da maneira que se pretendia, decidimos redesenhá-lo ao redesenhar o teste tínhamos várias opções e caminhos que podíamos seguir sabíamos que queríamos continuar usando cast 13, porque tínhamos um grande suprimento dessa enzima devido a uma colaboração contínua com o dr alain ghani também sabíamos que queríamos a todo custo manter a natureza isotérmica do neste teste uma das maiores vantagens do sherlock foi que ele não exigia grandes quantidades de equipamentos caros simplesmente usando um bloco de aquecimento ou algo do tipo era possível obter uma leitura visual decidimos, portanto, empregar amplificação isotérmica mediada por loop ou lâmpada para encurtar essa amplificação estratégia foi bastante bem documentada e fácil de executar com base no uso de seis primers técnica poderia amplificar rapidamente grandes quantidades de DNA alvo, ao contrário de rpa e pcr, no entanto lâmpada não cria amplicons idênticos de tamanho discreto, em vez disso, os seis primers podem interagir para criar moléculas muito maiores de uma sequência de repetição inicialmente era um pouco difícil incorpore essa estratégia de amplificação isotérmica em nosso teste, pois você pode se lembrar da etapa seguinte rpa no teste sherlock original foi aquele que produziu muitos e muitos rna alvo essa produção de rna alvo só foi possível, porque a etapa rpa adicionou uma tag que deixou o rna t7 polimerase se liga ao dna e começa a transcrevê-lo, no entanto, ninguém aparentemente nunca fez que com lâmpada e como essa nova técnica usou seis primers, dois dos quais se enrolaram para criar halteres estranhos como estruturas de estrutura, era difícil descobrir exatamente onde incorporar essa tag depois de um tempo, decidimos incluir a tag bem no meio de um de nossos primers de loop, isso tem sido consistentemente dado resultados muito fortes, fomos capazes de adaptar o sherlock original teste com uma nova estratégia de amplificação enquanto ainda se beneficia da especificidade e sinalização do cast 13 o novo teste está, portanto, usando rt lamp em vez de rt rpa, é claro devemos nos interessar em direcionar o DNA no futuro para certos tipos de vírus ou certas bactérias este teste seria prontamente aplicável a isso também decidimos usar um fluorescente repórter rna em vez do estilo de gravidez que falamos anteriormente, porque parecia ser o mais prontamente material disponível, uma vez que não é necessário nenhum maquinário particularmente avançado para fazê-lo funcionar ficamos felizes em escolher este agora que você sabe como o teste funciona do ponto de vista teórico, vamos discuti-lo de um ponto de vista mais prático por enquanto o teste requer que comecemos com rna que foi extraído de um vírus usando um kit comercialmente disponível microlitro desta solução é transferido para o tubo contendo a reação da lâmpada rt idealmente, no futuro, gostaríamos de modificar o teste para que seja possível adicionar diretamente a saliva de um paciente a ele e continuar a partir daí, o que reduziria visivelmente o trabalho necessário para obter cada leitura reduzir o custo geral e tornar muito mais rápido os resultados depois de transferir um microlitro do extrato de rna para o primeiro tubo, o tubo deve ser incubado a 65 graus Celsius por 30 minutos depois que um microlitro é transferido do primeiro tubo no segundo que contém o t7 e lance a solução 13 depois de bater no tubo algumas vezes para misture e microcentrifugue por alguns segundos tudo o que você precisa fazer é incubar esse tubo a 37 graus Celsius por 30 minutos nesse ponto todas as reações são feitas e que os resultados estão prontos para serem ler expondo os tubos a um comprimento de onda de aproximadamente 490 nanômetros é possível detectar facilmente quais amostras contêm cyrus cov2 aquelas que irão fluorescer um verde brilhante aqueles que não continham nenhum dos espécimes virais de interesse serão completamente incolores e indistinguíveis de um tubo cheio com um pouco de água eu vou te mostrar que mais tarde agora vale a pena notar que as sequências de dna e rna que usamos nesta primeira versão do nosso teste foram todos publicados anteriormente por diferentes grupos como tal, não acreditamos que resultem em um sinal positivo quando na presença de um rna relevante isso é particularmente importante, porque sua saliva está cheia de rna o processo de extração do vírus de fato resulta na captura de rnas virais, mas tende a haver muito mais rnas humanos e bacterianos, além de outros coronavírus que são muito menos perigosos são bastante comuns na população humana se nossos testes deram sinais positivos toda vez que alguém entrou com um resfriado comum, não seria muito eficaz, pois nos baseamos em modelos descritos anteriormente para tentar evitar isso o máximo possível ao projetar este teste, tentamos garantir que ele não dependesse excessivamente de máquinas complicadas queríamos que todo o teste fosse fácil de realizar usando apenas alguns aparelhos comuns de laboratório como resultado, com esta iteração atual do teste, tudo o que precisamos é de uma máquina que possa aquecer tubos estilo pcr a 65 graus celsius e um que pode aquecer os tubos pcr a 37 graus celsius também precisamos de dois p2 ou p10 pipetas por motivos que abordaremos mais tarde, juntamente com suas pontas de peptídeos associadas uma pequena microcentrífuga capaz de receber tubos de PCr também é necessária apenas para garantir que a reação misturas não tocam no topo do tubo quando você os abre e potencialmente contaminam todos os tubos circundantes, finalmente, é necessária uma máquina capaz de emitir comprimentos de onda ultravioleta nesta imagem você verá a máquina que tenho usado é mais comumente usada para visualizar géis em uma biologia molecular lab, mas faz um trabalho muito bom ao visualizar nossas amostras positivas em nosso teste para as duas incubações períodos várias opções diferentes estão disponíveis eu tenho usado um termociclador antigo hoje como considera-se clinicamente que ele faz um bom trabalho de aquecimento uniforme dos meus tubos, vale a pena notar aqui que isso significa que mesmo termocicladores antigos e degradados que não fazem mais um bom trabalho de ciclismo entre temperaturas pode ser prontamente usado neste teste, ao contrário do padrão ouro rtq pcr atual que requer termocicladores especializados em tempo real aqui qualquer máquina antiga pode ser usada também é possível usar outros aparelhos comuns de laboratório, como aquecedores de bloco que têm um adaptador para tubos pcr por favor note que nesta foto o aquecedor do bloco tem um adaptador para 1,5 tubos de microcentrífuga milimétricos para que o verdadeiro adaptador pareça um pouco diferente também usei incubadoras com grande sucesso, mesmo incubadoras bacterianas que operam a 37 graus constantes celsius pode atender perfeitamente às necessidades deste teste, desde que os tubos sejam prontamente expostos à temperatura ambiente, os sinais positivos não devem ter dificuldade em resolver observe, no entanto, que ao usar incubadoras, é melhor ter os tubos expostos ao ar assim eles não perdem tempo enquanto o rack começa a esquentar lentamente os banhos de água são uma opção final que pode escolher pessoalmente, tendo a tendência de evitar esta opção, porque acho que o risco de contaminação cruzada entre amostras é muito maior e, portanto, não ideal no entanto, tentei realizar reações de lâmpada rt com este sistema e desde que você esteja cuidado é muito possível fazê-lo, uma vez que as reações tenham sido concluídas, é possível usar várias máquinas diferentes para visualizar os tubos dependendo da materiais que seu laboratório tem pessoalmente minha máquina de escolha é um emissor de uv de gel essas máquinas que são mais comumente usadas para visualizar géis de agarose fazem um trabalho muito bom em mostrar com segurança quais tubos são fluorescentes e quais não são luzes negras também podem ser usadas para este teste, no entanto, achei-os um pouco menos desejáveis, pois o repórter rna absorve melhor comprimentos de onda de 490 nanômetros descobri que as luzes negras que produzem comprimentos de onda de 390 nanômetros para ser menos favorável para este teste para eles funcionarem é melhor visualizar os tubos em um quarto escuro em ambos os casos a máquina deve realmente ser colocada em uma sala mais escura longe da luz excessiva um pouco a luz de fundo parece ter menos efeito no caso da luz uv em gel, no entanto esta foto vista à esquerda foi tirada usando um iphone genérico quando os tubos foram colocados no gel uv acender as luzes da sala foram apenas parcialmente desligadas, resultando em muita iluminação ambiente mesmo que não houvesse luzes apontadas diretamente para a máquina, dada a radiação forte e uniforme que os tubos recebido nesta máquina é fácil determinar quais amostras foram positivas e quais foram negativas no caso da luz negra à direita fica claro quais amostras são positivas e quais são negativas claro, no entanto, a fluorescência não é uniforme e é um pouco mais difícil de detectar a olho nu, neste caso, a câmera do iphone tirou uma foto muito boa e tornou mais fácil visualizar os tubos em geral, agora existem vários importantes considerações a serem feitas ao usar este teste para que ele funcione corretamente e não dê falsos positivos ou falsos negativos, é importante primeiro designar estações de trabalho adequadas para cada seção do teste.

Necessário seguir os tempos de reação pré-determinados sem variar, caso contrário os resultados podem começar a diferem ligeiramente, finalmente, aqueles que manuseiam o teste devem ter cuidado para não contaminar nenhum dos tubos com rnases a primeira consideração para separar áreas de trabalho é extremamente importante, porque o cordeiro é excessivamente sensível esta técnica é conhecida por produzir lotes e muito DNA alvo concentrado nós, assim como outros, notamos que quando abrimos tubos que completaram a amplificação da lâmpada na mesma área que originalmente usamos para preparar a reação é possível contaminar a área de trabalho com aerossóis contendo o produto se você continuar a configurar as reações da lâmpada nessas áreas depois, corre o risco de contaminando seus novos tubos com amplicons das reações anteriores, tocando sua mesa ou várias outras superfícies contaminadas com suas luvas, você corre o risco de semear artificialmente sua reação misturas que contêm rna do paciente sem sarisco v2 e, portanto, produzem resultados positivos quando realmente não deveria haver nenhuma separando as áreas nas quais você configura as reações da lâmpada e aqueles em que você usa as sequências amplificadas você corre menos risco de isso acontecer é também é necessário ter pipetas designadas para jalecos e outros materiais para cada estação de trabalho se aqueles na estação de trabalho 2 forem contaminados, você não deseja que isso volte para a estação de trabalho 1.

Observe que isso é muito menos rigoroso ao trazer materiais da estação de trabalho 1 para a estação de trabalho 2. Uma vez que é a reacção da lâmpada rt que corre o maior risco de contaminação trazer material por exemplo luvas dessa estação para a próxima não deve ser um problema, desde que as luvas ainda estejam relativamente limpo, observe que esta situação de contaminação por aerossol é de muito menos importância durante a segunda etapa do teste, pois discutimos anteriormente o elenco 13 proteína que estamos usando requer uma quantidade relativamente grande de rna para ser funcional no momento, não estamos preocupados com a contaminação por aerossol da lâmpada pode produzir falsos positivos de nossas reações do elenco 13, pois ainda temos que ver uma única situação onde isso aconteceu, a segunda consideração digna de nota é que o tempo de reação deve ser seguido uma pequena discrepância pode ser tolerada que seja um minuto a mais ou a menos não realmente parecem ter um grande impacto no teste, no entanto, mais do que isso pode começar a se tornar problemático no caso das equipes externas de reação à lâmpada rt, assim como nós vimos que dobrando a reação tempo para a lâmpada podem surgir falsos positivos como você pode ver aqui em ambas as fotos uma reação bem-sucedida da lâmpada também pode ser visualizada em um gel de agarose, as reações bem-sucedidas são caracterizada pela presença de várias bandas grandes de tamanhos variados, no entanto, quando a lâmpada as reações continuam por muito tempo é possível começar a amplificar amostras sem nada nelas por exemplo à esquerda você verá um gel que foi retirado de um artigo no qual em 30 minutos os poços contendo reações com 10 cópias do alvo são RNA viral e nenhuma cópia do o rna viral alvo não tinha bandas no caso do gel à direita um gel que fiz três dos poços continha reações que não tinham rna alvo para falar apenas do fragmento n bem contido rna alvo em 30 minutos esses controles negativos não demonstraram qualquer amplificação como esperávamos, no entanto, em 60 minutos, tanto o gel publicado quanto o meu começaram para dar produtos amplificados em seu caso as cópias de dez e zero começaram a ser amplificadas e no meu caso uma das minhas amostras negativas começou a ser amplificada eu realizei vários experimentos até agora com tempos de incubação de 30 minutos e até agora nunca obtiveram falsos positivos para não dizer que é totalmente impossível simplesmente que é muito improvável como um nota lateral este é um bom momento para mencionar que trocar as luvas com frequência ao realizar a primeira reação é uma boa maneira de evitar esse tipo de falsos positivos improváveis ​​após o uso prolongado, as luvas podem se tornar contaminados com pequenas quantidades de RNA viral e que poderiam levar a falsos positivos mesmo se estivéssemos apenas incubando em 30 minutos a consideração final a ser observada é a presença de rnases para aqueles que podem não estar familiarizados com rnases são enzimas que clivam todos os rnas que encontrarem ambos os passos para este teste são sensíveis a rnases a lâmpada artística inicial começa sua amplificação a partir de rna, de modo que a presença de rnases pode ser muito prejudicial e, portanto, levar a falsos negativos a segunda etapa do teste o t7 e o elenco de 13 etapas usam um repórter de rna para sinalizar tubos positivos se enquanto você estiver usando os testes você começar a introduzir rnases então você corre o risco de obter falsos positivos rnases são extremamente difíceis de remover, uma vez que eles são introduzidos em um sistema, então o melhor meio de proteger seu teste é usando a prevenção, uma vez que as suas mãos produzem muitos rnases é obrigatório o uso de luvas sempre ao trabalhar com o teste ao fazer isso, você evitará que as rnases naturais do seu corpo degradem o cov2 da estrela inicial rna e proteger o repórter fluorescente no final as luvas também devem ser trocadas sempre que eles entram em contato com o cabelo da pele ou outros objetos frequentemente manipulados como maçanetas e dispositivos pessoais o uso de rnas e dnase free pipetas filtradas também é importante para este teste usando esses tipos de pontas especializadas você pode ter certeza de que quaisquer possíveis contaminações que você possa ter em suas pipetas não tenham chance contaminar seu teste em áreas onde o risco de contaminação por rnas é bastante alto pode valer a pena tratar todas as superfícies ou ferramentas com uma solução de remoção de rnas tipos de soluções podem degradar rnases que poderiam grudar em suas luvas e contaminar suas amostras por favor, note que eu não tive que usar a solução com muita frequência, desde que você mantenha um horário de trabalho você deve estar bem o segundo componente para o teste o que contém t7 e cast 13 também é projetado para tolerar um certo nível de rnases contaminantes há um inibidor de rnas adicionado à mistura de reação para evitar a degradação do repórter no caso do sars kobe 2 rna original não estava completamente limpo ou no caso de ocorrerem contaminações enquanto você preparava os testes que disse que a presença de rnases excessivos ainda pode ativar totalmente o teste visto aqui à direita um microlitro de rnase a muito concentrada é capaz de fazer com que o tubo de ensaio tornar-se fluorescente, portanto, é importante levar a requerido cabrillo teste que pode ser amplamente distribuído e, ao mesmo tempo, atender a esse limite de detecção, é totalmente funcional para conter a propagação desta pandemia enquanto rt-qpcr é muito mais sensível do que isso, sua detecção limitada aprimorada pode não ser necessariamente tão benéfica, uma vez que esta técnica pode pegar rnas liberados por células infectadas e mortas após a infecção seguir seu curso, essa forma de triagem pode fazer com que indivíduos nominalmente sars kovi sejam positivos, mas não sejam realmente infeccioso para ser isolado desnecessariamente como você pode ver aqui à nossa esquerda teste de detecção é capaz de detectar amostras que possuem 100 cópias por microlitro como foi estipulado pelo modelo mais comparação recente entre os diferentes primers que usamos para a lâmpada demonstrou que uma versão do nosso teste pode detectar amostras contendo apenas 80 cópias por microlitro, enquanto o outro só pode detectar amostras contendo 1 000.

No futuro, provavelmente concentraremos nossos esforços no primeiro conjunto de cartilhas para garantir que atendemos o limite de detecção que foi estipulado pelo modelo como nota final, estamos felizes em informar que nosso teste funciona não apenas em fragmentos do cyrus genoma cov2 também funciona quando exposto ao perfil completo de rna do vírus inicialmente começamos o desenvolvimento do nosso teste usando fragmentos dos genes do vírus que tínhamos nos transcrevemos no laboratório recentemente, usamos o teste em vírus sars cov2 e obtivemos os resultados esperados, como você pode ver à esquerda a primeira seção da reação a reação da lâmpada rt funciona exatamente como esperado no rna viral os poços superiores esquerdos que foram executados no gel de agarose demonstram claramente uma forte amplificação abaixo deles três reações foram realizadas com células que não haviam sido cultivadas com o vírus os rnas virais foram criados pela primeira isolando os vírus de um paciente, esses vírus foram então cultivados em células viroe6 e após alguns dias o meio de cultura foi tratado para extrair todo e qualquer rna que estivesse presente no os vírus foram, portanto, destruídos e seu rna foi obtido quando os amplicons de laboratório que haviam amplificado o vírus real foram transferidos para a segunda fase do teste eles deram o esperado fortes sinais fluorescentes no momento o que resta a ser feito é usar nossos testes em amostras que foram confirmados positivos ou negativos por rtq pcr o padrão ouro atual em sarsko v2 detecção e ver como nosso teste se compara isso nos dará uma indicação melhor do que nossos testes de sensibilidade e especificidade são apenas para encerrar gostaria de agradecer ao dr gary cobinger dr ellen gianni e dr ghibwave por terem ajudado a fornecer financiamento ou materiais para este projeto eu também gostaria de agradecer ao dr tremblay e a todos em sua equipe por ter ajudado a fornecer alguns insights enquanto eu redesenhava este teste, finalmente gostaria de agradecer ao Dr.

Marcello Bossoispor tendo ajudado a organizar todo este encontro e o instituto canadense de pesquisa em saúde e os frqs por terem me ajudado a me financiar enquanto eu seguia este projeto ok então essa foi minha apresentação uh sim obrigado gabriel uh eu vou tomar o tempo apenas para fazer um uh para resumir o melhor que posso aqui para os que não falam inglês muito obrigado pela apresentação obrigado ok.

Desdobramento em Medicina Baseada em Evidências: Imunologia Vacinal e Imunoterapia Alérgeno-Específica

Na Medicina Baseada em Evidências (OMS, EAACI e ASBAI), distinguem-se duas estratégias complementares de modulação do sistema imune: (1) as vacinas imunizantes preventivas anti-infecciosas, que estimulam a imunidade adaptativa humoral (anticorpos neutralizantes IgG/IgA) e celular (linfócitos T de memória) contra patógenos virais e bacterianos; e (2) a imunoterapia alérgeno-específica (vacinas para alergia), único tratamento modificador da história natural das doenças alérgicas mediadas por IgE. A administração controlada e progressiva de extratos alergênicos padronizados promove o desvio imunológico do perfil Th2 para Th1, induz a expansão de linfócitos T reguladores (CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺) produtores de IL-10 e TGF-β e estimula a síntese de anticorpos bloqueadores da subclasse IgG4, reduzindo de forma sustentada a hiper-reatividade clínica e a necessidade de fármacos sintomáticos.

Mecanismos da Alergia Alimentar, Diagnóstico Preciso e Manejo Nutricional

Alergia IgE-Mediada, Mista e Diferença para Intolerâncias Enzimáticas

O sistema imunológico associado à mucosa gastrointestinal atua normalmente mantendo tolerância oral diante de milhares de proteínas da dieta. Quando há quebra dessa barreira imunitária — influenciada por predisposição genética, disbiose da microbiota intestinal ou imaturidade da IgA secretora na infância —, frações proteicas intactas sensibilizam mastócitos e basófilos. Por isso, um exame de sangue isoladamente positivo reflete apenas sensibilização biológica, devendo sempre ser correlacionado à história clínica e, quando necessário, ao teste de provocação oral supervisionado em ambiente médico.

Leitura de Rótulos, Dessensibilização e Segurança Alimentar

O manejo bem-sucedido baseia-se na educação sobre contaminação cruzada, leitura criteriosa de rótulos regulados pela Anvisa e realização de teste de alergia para mapear os verdadeiros gatilhos clínicos. Quando confirmado o diagnóstico, instituir protocolos de vacina para alergia ao leite individualizados — aliados ao acompanhamento de comorbidades respiratórias como vacina para alergia conforme o perfil imunológico — oferece proteção efetiva e melhora expressiva da qualidade de vida familiar.

Disfunção Epitelial, Microbioma da Pele e Sensibilização Tardia

A pele atua como o primeiro órgão de defesa imunológica do organismo humano. Na dermatite atópica, alterações genéticas em proteínas estruturais do estrato córneo (como a filagrina) e na composição de ceramidas provocam perda transepidérmica de água, ressecamento acentuado e entrada facilitada de ácaros e aeroalérgenos. Esse microambiente ativa citocinas do perfil Th2 (especialmente IL-4, IL-13 e IL-31, diretamente ligada ao prurido intenso) e favorece a colonização pelo Staphylococcus aureus, cujos superantígenos perpetuam as crises eczematosas.

Mecanismos Vacinais, Excipientes e Avaliação da Competência Imunitária

Na avaliação da competência do sistema imune — seja em infecções de repetição, alterações laboratoriais de imunoglobulinas (IgG, IgA, IgM, IgE) ou em pessoas vivendo com HIV sob acompanhamento da contagem de linfócitos T CD4 —, distingue-se criteriosamente o uso de vacinas inativadas/subunidades (amplamente seguras mesmo em imunossuprimidos) das vacinas de agentes vivos atenuados, cuja indicação depende do grau de preservação da imunidade celular. Ademais, pacientes em uso de imunoterapia antialérgica podem manter seu calendário vacinal respeitando apenas pequenos intervalos operacionais orientados pela equipe médica.

Impacto na Qualidade de Vida, Sono e Bem-Estar Sistêmico

Além das manifestações físicas diretas, quadros não controlados ligados a Parte 5 interferem profundamente na arquitetura do sono reparador, na capacidade de concentração escolar e profissional e no equilíbrio emocional. O estresse crônico, por meio de mediadores neuroendócrinos e alarminas epiteliais, retroalimenta a resposta inflamatória imunitária. Dessa forma, instituir uma abordagem integral de reabilitação clínica e ambiental restaura a autonomia diária e o bem-estar global do indivíduo.

Importância do Diagnóstico Diferencial e da Anamnese Detalhada

Na especialidade de Alergia e Imunologia, dois pacientes com sintomas aparentemente semelhantes envolvendo Parte 5 podem apresentar mecanismos fisiopatológicos completamente distintos. Por essa razão, a história clínica minuciosa — investigando cronologia das crises, ambiente domiciliar e profissional, histórico familiar de atopia, uso de fármacos concomitantes e hábitos alimentares — funciona como bússola indispensável para interpretar corretamente exames laboratoriais (como dosagem de IgE total e específica) e provas funcionais. Um resultado laboratorial isolado jamais substitui o julgamento clínico presencial ou por telemedicina especializada, prevenindo diagnósticos equivocados e tratamentos desnecessários.

Prevenção Ambiental, Adesão Terapêutica e Monitoramento Contínuo

O sucesso a longo prazo no manejo das condições alérgicas e imunológicas depende diretamente da aliança entre tratamento médico direcionado e medidas educativas cotidianas. Manter ambientes bem ventilados e livres de acúmulo de poeira doméstica, preservar a hidratação fisiológica das mucosas e da barreira cutânea, respeitar rigorosamente os horários e a técnica de uso das medicações preventivas prescritas e realizar revisões periódicas permitem estabilizar a inflamação subclínica antes que ela evolua para exacerbações agudas.

Critérios de Segurança Clínica e Sinais de Alerta em Alergologia

Reconhecer precocemente os sinais de alerta que exigem reavaliação médica prioritária faz parte da educação em saúde de todo paciente e familiar. Sintomas como dispneia progressiva (dificuldade para respirar ou falar frases completas), chiado torácico refratário, edema súbito de lábios, língua ou glote, tontura por queda pressórica, febre persistente associada a lesões de pele ou acometimento de mucosas demandam atendimento imediato de urgência, seguido de investigação alergológica estruturada para prevenir recorrências futuras.

Perguntas Complementares Frequentes na Prática Clínica

Reações Imunológicas a Picadas de Insetos e Prevenção de Crises: Na prática alergológica, distinguir um edema inflamatório local de uma reação alérgica sistêmica é decisivo para proteger a vida do paciente. Na hipersensibilidade a mosquitos, ocorre resposta imune mista (imediata mediada por IgE e tardia celular por linfócitos T), fazendo com que uma única picada reative lesões antigas pelo corpo. Já nas reações a abelhas e marimbondos, sintomas à distância do local da ferroada — como placas generalizadas, rouquidão, broncoespasmo ou queda de pressão arterial — caracterizam anafilaxia e demandam conduta imediata.

Imunologia da Mucosa Digestiva: Eixo Intestino-Vias Aéreas e Diagnóstico Diferencial: O equilíbrio entre a microbiota comensal e a mucosa digestiva regula diretamente a tolerância imunológica sistêmica. Proteínas como a gliadina podem modular a liberação de zonulina em indivíduos geneticamente suscetíveis (portadores de alelos HLA-DQ2 ou HLA-DQ8 na doença celíaca), ampliando a permeabilidade intestinal e perpetuando cascatas inflamatórias locais e extraintestinais. A distinção criteriosa entre autoimunidade celíaca, alergia ao trigo IgE-mediada e fermentação de carboidratos Fodmaps evita condutas inadequadas.

Saúde da Barreira Cutânea, Inflamação Imunológica e Controle do Prurido: A pele atua como o primeiro órgão de defesa imunológica do organismo humano. Na dermatite atópica, alterações genéticas em proteínas estruturais do estrato córneo (como a filagrina) e na composição de ceramidas provocam perda transepidérmica de água, ressecamento acentuado e entrada facilitada de ácaros e aeroalérgenos. Esse microambiente ativa citocinas do perfil Th2 (especialmente IL-4, IL-13 e IL-31, diretamente ligada ao prurido intenso) e favorece a colonização pelo Staphylococcus aureus, cujos superantígenos perpetuam as crises eczematosas.

Imunologia das Doenças Autoimunes Cutâneas e Cuidado Integrado: Na interface entre a Imunologia Clínica, a Dermatologia e a Reumatologia, avaliar o paciente de forma sistêmica permite reconhecer precocemente comorbidades metabólicas, articulares e eventuais hipersensibilidades coexistentes. Exames como o Fator Antinuclear (FAN) e provas inflamatórias atuam como ferramentas de triagem que só adquirem significado diagnóstico real quando interpretados à luz do exame físico detalhado da pele, unhas, couro cabeludo e articulações.

Fisiopatologia das Urticárias e do Angioedema: Diagnóstico e Controle Seguro: As urticárias caracterizam-se pelo surgimento súbito de urticas (pápulas eritematosas e edematosas intensamente pruriginosas e fugazes, que desaparecem em menos de 24 horas no mesmo ponto sem deixar cicatriz), podendo acompanhar-se de angioedema nas camadas profundas da derme e submucosa. Nos quadros agudos (duração inferior a seis semanas), infecções virais, alimentos e medicamentos figuram entre os gatilhos clássicos; já na urticária crônica espontânea ou nas urticárias induzidas (dermográfica, colinérgica pelo suor/aquecimento, ao frio ou à pressão tardia), mecanismos autoimunes ou de hiper-reatividade mastocitária assumem papel central.

Controle da Inflamação Brônquica, Função Pulmonar e Prevenção do Remodelamento: O monitoramento objetivo por meio da espirometria (prova de função pulmonar com teste broncodilatador) é indispensável mesmo nos períodos em que o paciente acredita estar assintomático, pois detecta obstruções silenciosas em pequenas vias aéreas. Os corticoides inalatórios modernos atuam diretamente na mucosa respiratória em doses medidas em microgramas, oferecendo elevada segurança sistêmica, reduzindo exacerbações graves e protegendo a capacidade respiratória a longo prazo.

Via Aérea Unificada: Manejo da Rinite, Rinossinusite e Hipersensibilidade Nasal: O nariz exerce funções vitais de filtragem, aquecimento e umidificação do ar inspirado antes que ele alcance os pulmões. Na rinite alérgica e na rinossinusite crônica, o contato de aeroalérgenos — sobretudo ácaros da poeira doméstica (Dermatophagoides pteronyssinus e Blomia tropicalis), fungos anemófilos e epitélios — com anticorpos IgE fixados nos mastócitos da mucosa nasal dispara liberação imediata de histamina, leucotrienos e prostaglandinas. Esse processo gera obstrução nasal, prurido, espirros em salva, gotejamento pós-nasal (causa frequente de tosse crônica noturna) e fragilidade vascular que pode favorecer pequenos sangramentos (epistaxe) pelo trauma ao assoar ou pelo jato mal direcionado de sprays.

Segurança Farmacológica, Reações Adversas a Medicamentos e Uso Racional de Corticoides: Outro ponto crítico de farmacovigilância diz respeito ao uso indiscriminado de corticoides sistêmicos orais ou injetáveis de depósito de longa ação (como associações de betametasona intramuscular). Embora promovam alívio rápido aparente, aplicações repetidas suprimem o eixo hipotálamo-hipófise-suprarrenal, elevam a pressão arterial e a glicemia, desmineralizam a massa óssea, fragilizam a imunidade contra infecções e podem provocar dor neuropática local quando aplicadas inadequadamente na região glútea.

Imunização Segura, Resposta Imunológica e Proteção do Paciente Alérgico: A imunização preventiva representa uma das maiores conquistas da medicina para reduzir hospitalizações e complicações infecciosas graves, especialmente em portadores de doenças respiratórias crônicas (como asma e DPOC), cardiopatias, hipertensão arterial e diabetes. Pacientes alérgicos a aeroalérgenos, alimentos ou medicamentos comuns não possuem contraindicação geral às vacinas; a atenção alergológica concentra-se na avaliação específica de raros casos de anafilaxia prévia a componentes isolados da fórmula (como polietilenoglicol, polissorbato ou traços proteicos específicos), situações que hoje contam com protocolos seguros de aplicação assistida.

Medicina de Precisão: Como Funcionam os Anticorpos Monoclonais e Imunobiológicos: A escolha do imunobiológico ideal exige fenotipagem e endotipagem rigorosas pelo médico especialista, avaliando biomarcadores sanguíneos (contagem de eosinófilos periféricos, níveis séricos de IgE total e fração exalada de óxido nítrico) e comorbidades coexistentes, como asma grave, polipose nasal, urticária crônica espontânea refratária e dermatite atópica moderada a grave. As aplicações subcutâneas seguem cronograma regular sob supervisão assistencial segura.

Conclusão e Síntese das Orientações

Conclui-se que o manejo eficiente das questões relacionadas a Parte 5 apoia-se na união entre informação científica de qualidade, prevenção ambiental e terapêutica direcionada ao perfil de cada paciente. Diante de sintomas persistentes ou recorrentes, buscar avaliação com médico Alergista e imunologista — integrando investigação diagnóstica criteriosa e opções consolidadas de cuidado especializado em alergia e imunologia sempre que indicadas — garante segurança clínica e proteção duradoura da saúde.

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